細(xì)胞培養(yǎng)的一般過(guò)程

一、準(zhǔn)備工作
準(zhǔn)備工作對(duì)開(kāi)展細(xì)胞培養(yǎng)異常重要，工作量也較大，應(yīng)給予足夠的重視，推備工作中某一環(huán)節(jié)的疏忽可導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗或無(wú)法進(jìn)行。準(zhǔn)備工作的內(nèi)容包括器皿的清洗、干燥與消毒，培養(yǎng)基與其他試劑的配制、分裝及滅菌，無(wú)菌室或超凈臺(tái)的清潔與消毒，培養(yǎng)箱及其他儀器的檢查與調(diào)試，具體內(nèi)容可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
二、取材
在無(wú)菌環(huán)境下從機(jī)體取出某種組織細(xì)胞（視實(shí)驗(yàn)?zāi)康亩�定），�?jīng)過(guò)一定的處理（如消化分散細(xì)胞、分離等）后接入培養(yǎng)器血中，這一過(guò)程稱(chēng)為取材。如是細(xì)胞株的擴(kuò)大培養(yǎng)則無(wú)取材這一過(guò)程。機(jī)體取出的組織細(xì)胞的首次培養(yǎng)稱(chēng)為原代培養(yǎng)。
理論上講各種動(dòng)物和人體內(nèi)的所有組織都可以用于培養(yǎng)，實(shí)際上幼體組織（尤其是胚胎組織）比成年個(gè)體的組織容易培養(yǎng)，分化程度低的組織比分化高的容易培養(yǎng)，腫瘤組織比正常組織容易培養(yǎng)。取材后應(yīng)立即處理，盡快培養(yǎng)，因故不能馬上培養(yǎng)時(shí)，可將組織塊切成黃豆般大的小塊，置4℃的培養(yǎng)液中保存。取組織時(shí)應(yīng)嚴(yán)格保持無(wú)菌，同時(shí)也要避免接觸其他的有害物質(zhì)。取病理組織和皮膚及消化道上皮細(xì)胞時(shí)容易帶菌，為減少污染可用抗菌素處理。
由組織并分離分散細(xì)胞的方法可參閱有關(guān)文獻(xiàn)。
三、培養(yǎng)
將取得的組織細(xì)胞接入培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中的過(guò)程稱(chēng)為培養(yǎng)。如系組織塊培養(yǎng)，則直接將組織塊接入培養(yǎng)器皿底部，幾個(gè)小時(shí)后組織塊可貼牢在底部，再加入培養(yǎng)基。如系細(xì)胞培養(yǎng)，一般應(yīng)在接入培養(yǎng)器皿之前進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，按要求以一定的量（以每毫升細(xì)胞數(shù)表示）接入培養(yǎng)器皿并直接加入培養(yǎng)基。細(xì)胞進(jìn)入培養(yǎng)器皿后，立即放入培養(yǎng)箱中，使細(xì)胞盡早進(jìn)入生長(zhǎng)狀態(tài)。
正在培養(yǎng)中的細(xì)胞應(yīng)每隔一定時(shí)間觀察一次，觀察的內(nèi)容包括細(xì)胞是否生長(zhǎng)良好，形態(tài)是否正常，有無(wú)污染，培養(yǎng)基的PH是否太酸或太堿（由酚紅指示劑指示），此外對(duì)培養(yǎng)溫度和CO2濃度也要定時(shí)檢查。
一般原代培養(yǎng)進(jìn)入培養(yǎng)后有一段潛伏期（數(shù)小時(shí)到數(shù)十天不等），在潛伏期細(xì)胞一般不分裂，但可貼壁和游走。過(guò)了潛伏期后細(xì)胞進(jìn)入旺盛的分裂生長(zhǎng)期。細(xì)胞長(zhǎng)滿瓶底后要進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將一瓶中的細(xì)胞消化懸浮后分至兩到三瓶繼續(xù)培養(yǎng)。每傳代一次稱(chēng)為“一代”。二倍體細(xì)胞一般只能傳幾十代，而轉(zhuǎn)化細(xì)胞系或細(xì)胞株則可無(wú)限地傳代下去。轉(zhuǎn)化細(xì)胞可能具有惡性性質(zhì)，也可能僅有不死性（Immortality）而無(wú)惡性。
培養(yǎng)正在生長(zhǎng)中的細(xì)胞是進(jìn)行各種生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)的良好材料。
四、凍存及復(fù)蘇
為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存。凍存的溫度一般用液氮的溫度—－196℃，將細(xì)胞收集至凍存管中加入含保護(hù)劑（一般為二甲亞砜或甘油）的培養(yǎng)基，以一定的冷卻速度凍存，最終保存于液氮中。在極低的溫度下，細(xì)胞保存的時(shí)間幾乎是無(wú)限的。
復(fù)蘇一般采用快融方法，即從液氮中取出凍存管后，立即放入37℃水中，使之在一分鐘內(nèi)迅速融解。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)器皿中進(jìn)行培養(yǎng)。
凍存過(guò)程中保護(hù)劑的選用、細(xì)胞密度、降溫速度及復(fù)蘇時(shí)溫度、融化速度等都對(duì)細(xì)胞活力有影響。

培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)

一、體內(nèi)、外細(xì)胞的差異和分化
1、差異：細(xì)胞離體后，失去了神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細(xì)胞間的相互影響，生活在缺乏動(dòng)態(tài)平衡的相對(duì)穩(wěn)定環(huán)境中，日久天長(zhǎng)，易發(fā)生如下變化：分化現(xiàn)象減弱；形態(tài)功能趨于單一化或生存一定時(shí)間后衰退死亡；或發(fā)生轉(zhuǎn)化獲得不死性，變成可無(wú)限生長(zhǎng)的連續(xù)細(xì)胞系或惡性細(xì)胞系。因此，培養(yǎng)中的細(xì)胞可視為一種在特定的條件下的細(xì)胞群體，它們既保持著與體內(nèi)細(xì)胞相同的基本結(jié)構(gòu)和功能，也有一些不同于體內(nèi)細(xì)胞的性狀。實(shí)際上從細(xì)胞一旦被置于體外培養(yǎng)后，這種差異就開(kāi)始發(fā)生了。
雖然體外細(xì)胞與機(jī)體細(xì)胞存有差異，但并未失去研究的意義。且不論其有許多性狀仍與體內(nèi)相同（如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞仍可博動(dòng)），只從細(xì)胞遺傳學(xué)（Cyto－genetics）的角度看，離體細(xì)胞仍帶有全套的二倍體基因。細(xì)胞在培養(yǎng)中的表現(xiàn)，只不過(guò)是相應(yīng)基因關(guān)閉／開(kāi)啟引起的現(xiàn)象，這并非是絕對(duì)缺陷。恰恰相反，在培養(yǎng)的細(xì)胞中某些特定功能的喪失，可為該基因的表達(dá)與調(diào)控提供線索。
2、分化；體外培養(yǎng)的細(xì)胞分化能力并未完全喪失，只是環(huán)境的政變，細(xì)胞分化的表現(xiàn)和在體內(nèi)不同。細(xì)胞是否表現(xiàn)分化關(guān)鍵在于是否存在使細(xì)胞分化的條件，如Friend細(xì)胞（小鼠紅白血病細(xì)胞）在一定的因素作用下可以合成血紅蛋白，血管內(nèi)皮細(xì)胞在類(lèi)似基膜物質(zhì)底物上培養(yǎng)時(shí)能長(zhǎng)成血管狀結(jié)構(gòu)，雜交瘤細(xì)胞能產(chǎn)生特異的單克隆抗體，這些均屬于細(xì)胞分化行為。
二、體外培養(yǎng)細(xì)胞的分型
（一）貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，屬于貼壁依賴(lài)性細(xì)胞，判斷細(xì)胞形態(tài)時(shí)不能接體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：
1、成纖維細(xì)胞型：胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長(zhǎng)時(shí)呈放射狀。除真正的成纖維細(xì)胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細(xì)胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細(xì)胞的形態(tài)與成纖維類(lèi)似時(shí)皆可稱(chēng)之為成纖維細(xì)胞。
2、上皮型細(xì)胞：細(xì)胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細(xì)胞彼此緊密相連成單層膜。生長(zhǎng)時(shí)呈膜狀移動(dòng)，處于膜邊緣的細(xì)胞總與膜相連，很少單獨(dú)行動(dòng)。起源于內(nèi)、外胚層的細(xì)胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。
3、游走細(xì)胞型：呈散在生長(zhǎng)，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運(yùn)動(dòng)，方向不規(guī)則。此型細(xì)胞不穩(wěn)定，有時(shí)難以和其他細(xì)胞相區(qū)別。
4、多型細(xì)胞型：有一些細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類(lèi)。
（二）懸浮型；見(jiàn)于少數(shù)特殊的細(xì)胞，如某些類(lèi)型的癌細(xì)胞及白血病細(xì)胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長(zhǎng)。這類(lèi)細(xì)胞容易大量繁殖。
三、培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程
體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)在動(dòng)態(tài)平衡環(huán)境中，而組織培養(yǎng)細(xì)胞的生存環(huán)境是培養(yǎng)瓶、皿或其它容器，生存空間和營(yíng)養(yǎng)是有限的。當(dāng)細(xì)胞增殖達(dá)到一定密度后，則需要分離出一部分細(xì)胞和更新?tīng)I(yíng)養(yǎng)液，否則將影響細(xì)胞的繼續(xù)生存，這一過(guò)程叫傳代（Passage或Subculture）。每次傳代以后，細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖過(guò)程都會(huì)受一定的影響。另外，很多細(xì)胞特別是正常細(xì)胞，在體外的生存也不是無(wú)限的，存在著一個(gè)發(fā)展過(guò)程。所有這一切，使組織細(xì)胞在培養(yǎng)中有著一系列與體內(nèi)不同的生存特點(diǎn)。
（一）培養(yǎng)細(xì)胞生命期（Life Span of Culture Cells）
所謂培養(yǎng)細(xì)胞生命期，是指細(xì)胞在培養(yǎng)中持續(xù)增殖和生長(zhǎng)的時(shí)間。體內(nèi)組織細(xì)胞的生存期與完整機(jī)體的死亡衰老基本相一致。組織和細(xì)胞在培養(yǎng)中生命期如何？這要看細(xì)胞的種類(lèi)、性狀和原供體的年齡等情況。人胚二倍體成纖維細(xì)胞培養(yǎng)，在不凍存和反復(fù)傳代條件下，可傳30～50代，相當(dāng)于150～300個(gè)細(xì)胞增殖周期，能維待一年左右的生存時(shí)間，最后衰老凋亡（Apoptosis）。如供體為成體或衰老個(gè)體，則生存時(shí)間較短；如培養(yǎng)的為其它細(xì)胞如肝細(xì)胞或腎細(xì)胞，生存時(shí)間更短，僅能傳幾代或十幾代。只有當(dāng)細(xì)胞發(fā)生遺傳性改變，如獲永生性或惡性轉(zhuǎn)化時(shí)，細(xì)胞的生存期才可能發(fā)生改變。對(duì)此以后將詳述。
正常細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，不論細(xì)胞的種類(lèi)和供體的年齡如何，在細(xì)胞全生存過(guò)程中，大致都經(jīng)歷以下三個(gè)階段：
1．原代培養(yǎng)（Primary Culture）期：
也稱(chēng)初代培養(yǎng)，即從體內(nèi)取出組織接種培養(yǎng)到第一次傳代階段，一般持續(xù)1一4周。此期細(xì)胞呈活躍的移動(dòng)，可見(jiàn)細(xì)胞分裂，但不旺盛。初代培養(yǎng)細(xì)胞與體內(nèi)原組織在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能活動(dòng)上相似性大。細(xì)胞群是異質(zhì)的（Heterogeneous），也即各細(xì)胞的遺傳性狀互不相同，細(xì)胞相互依存性強(qiáng)。如把這種細(xì)胞群稀釋分散成單細(xì)胞，在軟瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即細(xì)胞獨(dú)立生存性差。克隆形成率即細(xì)胞群被稀釋分散成單個(gè)細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，形成細(xì)胞小群（克隆）的百分?jǐn)?shù)。初代培養(yǎng)細(xì)胞多呈二倍體核型；由于原代培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)細(xì)胞性狀相似性大，是檢測(cè)藥物很好的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。
2．傳代期：
初代培養(yǎng)細(xì)胞一經(jīng)傳代后便改稱(chēng)做細(xì)胞系（Cell Line）。在全生命期中此期的持續(xù)時(shí)間最長(zhǎng)。在培養(yǎng)條件較好情況下，細(xì)胞增殖旺盛，并能維持二倍體核型，呈二倍體核型的細(xì)胞稱(chēng)二倍體細(xì)胞系（Diploid Cell Line）。為保持二倍體細(xì)胞性質(zhì)，細(xì)胞應(yīng)在初代培養(yǎng)期或傳代后早期凍存。當(dāng)前世界上常用細(xì)胞均在不出十代內(nèi)凍存。如不凍存，則需反復(fù)傳代以維持細(xì)胞的適宜密度，以利于生存。但這樣就有可能導(dǎo)致細(xì)胞失掉二倍體性質(zhì)或發(fā)生轉(zhuǎn)化。一般情況下當(dāng)傳代10～50次左右，細(xì)胞增殖逐漸緩慢，以至完全停止，細(xì)胞進(jìn)入第三期。
3．衰退期：
此期細(xì)胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；細(xì)胞形態(tài)輪廓增強(qiáng)，最后衰退凋亡。在細(xì)胞生命期階段，少數(shù)情況下，在以上三期任何一點(diǎn)（多發(fā)生在傳代末或衰退期），由于某種因素的影響，細(xì)胞可能發(fā)生自發(fā)轉(zhuǎn)化（Spontaneous Transformation）。轉(zhuǎn)化的標(biāo)志之一是細(xì)胞可能獲得永生性（Immortality）或惡性性（Malignancy）。細(xì)胞永生性也稱(chēng)不死性，即細(xì)胞獲持久性增殖能力，這樣的細(xì)胞群體稱(chēng)無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line），也稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系（Continuous Cell Line）。在早期文獻(xiàn)中無(wú)限細(xì)胞系也稱(chēng)已建立細(xì)胞系（Established Cell Line），現(xiàn)已不用。無(wú)限細(xì)胞系的形成主要發(fā)生在第二期末，或第三期初階段。細(xì)胞獲不死性后，核型大多變成異倍體（Heteroploid）。細(xì)胞轉(zhuǎn)化亦可用人工方法誘發(fā)，轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞也可能具有惡性性質(zhì)。細(xì)胞永生性和惡性性非同一性狀。
（二）組織培養(yǎng)細(xì)胞一代生存期
所有體外培養(yǎng)細(xì)胞，包括初代培養(yǎng)及各種細(xì)胞系，當(dāng)生長(zhǎng)達(dá)到一定密度后，都需做傳代處理。傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞增殖速度等有關(guān)。接種細(xì)胞數(shù)量大、細(xì)胞基數(shù)大、相同增殖速度條件下，細(xì)胞數(shù)量增加與飽和速度相對(duì)要快（實(shí)際上細(xì)胞接種數(shù)量大時(shí)細(xì)胞增殖速度比稀少時(shí)要快）。連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞系比初代培養(yǎng)細(xì)胞增殖快，培養(yǎng)液中血清含量多時(shí)細(xì)胞增殖比少時(shí)快。以上情況都會(huì)縮短傳代時(shí)間。
所謂細(xì)胞“一代”一詞，系僅指從細(xì)胞接種到分離再培養(yǎng)時(shí)的一段時(shí)間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣說(shuō)法，它與細(xì)胞倍增一代非同一含義。如某一細(xì)胞系為第153代細(xì)胞，即指該細(xì)胞系已傳代153次。它與細(xì)胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）不同；在細(xì)胞一代中，細(xì)胞能倍增3～6次。細(xì)胞傳一代后，一般要經(jīng)過(guò)以下三個(gè)階段：
1．潛伏期（Latent Phase）：
細(xì)胞接種培養(yǎng)后，先經(jīng)過(guò)一個(gè)在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)的懸浮期。此時(shí)細(xì)胞胞質(zhì)回縮，胞體呈圓球形。接著是細(xì)胞附著或貼附于底物表面上，稱(chēng)貼壁，懸浮期結(jié)束。各種細(xì)胞貼附速度不同，這與細(xì)胞的種類(lèi)、培養(yǎng)基成分和底物的理化性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞貼附慢，可長(zhǎng)達(dá)10～24小時(shí)或更多；連續(xù)細(xì)胞系和惡性細(xì)胞系快，10～30分鐘即可貼附。細(xì)胞貼附現(xiàn)象是一個(gè)非常復(fù)雜和與多種因素相關(guān)的過(guò)程。支持物能影響細(xì)胞的貼附；底物表面不潔不利貼附，底物表面帶有陽(yáng)性電荷利于貼附。另外在貼附過(guò)程中，有一些特殊物質(zhì)如纖維連接素（Fibronectin），又稱(chēng)LETS（Larger External Transformation Substance），細(xì)胞表面蛋白（Cell Surface Protein：CSP）等也參與貼附過(guò)程。這些物質(zhì)都是蛋白類(lèi)成分，它們有的存在于細(xì)胞膜的表面（如 CSP），有的則來(lái)自培養(yǎng)基中的血清（LETS）。近年又從各種不同組織和生物成分中提取出了很多促貼附物質(zhì)。貼附是貼附類(lèi)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖條件之一。
細(xì)胞貼附于支持物后，除先經(jīng)過(guò)前述延展過(guò)程變成極性細(xì)胞，還要經(jīng)過(guò)一個(gè)潛伏階段，才進(jìn)入生長(zhǎng)和增殖期。細(xì)胞處在潛伏期時(shí)，可有運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，基本無(wú)增殖，少見(jiàn)分裂相。細(xì)胞潛伏期與細(xì)胞接種密度、細(xì)胞種類(lèi)和培養(yǎng)基性質(zhì)等密切相關(guān)。初代培養(yǎng)細(xì)胞潛伏期長(zhǎng)，約24～96小時(shí)或更長(zhǎng)，連續(xù)細(xì)胞系和腫瘤細(xì)胞潛伏期短，僅6～24小時(shí)；細(xì)胞接種密度大時(shí)潛伏期短。當(dāng)細(xì)胞分裂相開(kāi)始出現(xiàn)并逐漸增多時(shí)，標(biāo)志細(xì)胞已進(jìn)入指數(shù)增生期。
2．指數(shù)增生期（Logarithmic growth Phase）：
這是細(xì)胞增值最旺盛的階段，細(xì)胞分裂相增多。指數(shù)增生期細(xì)胞分裂相數(shù)量可作為判定細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛與否的一個(gè)重要標(biāo)志。一般以細(xì)胞分裂（Mitotic Index：MI）表示，即細(xì)胞群中每1000個(gè)細(xì)胞中的分裂相數(shù)。體外培養(yǎng)細(xì)胞分裂指數(shù)受細(xì)胞種類(lèi)、培養(yǎng)液成分、pH、培養(yǎng)箱溫度等多種因素的影響。一般細(xì)胞的分裂指數(shù)介于0.1%～0.5%，初代細(xì)胞分裂指數(shù)低，連續(xù)細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞分裂指數(shù)可高達(dá)3%～5%。pH和培養(yǎng)液血清含量變動(dòng)對(duì)細(xì)胞分裂指數(shù)有很大影響。指數(shù)增生期是細(xì)胞一代中活力最好的時(shí)期，因此是進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)最好的和最主要的階段。在接種細(xì)胞數(shù)量適宜情況下，指數(shù)增生期持續(xù)3～5天后，隨細(xì)胞數(shù)量不斷增多、生長(zhǎng)空間漸趨減少、最后細(xì)胞相互接觸匯合成片。細(xì)胞相互接觸后，如培養(yǎng)的是正常細(xì)胞，由于細(xì)胞的相互接觸能抑制細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，這種現(xiàn)象稱(chēng)接觸抑制（Contact Inhibition）。而惡性細(xì)胞則無(wú)接觸抑制現(xiàn)象，因此接觸抑制可作為區(qū)別正常與癌細(xì)胞標(biāo)志之一。腫瘤細(xì)胞由于無(wú)接觸抑制能繼續(xù)移動(dòng)和增殖，導(dǎo)致細(xì)胞向三維空間擴(kuò)展，使細(xì)胞發(fā)生堆積（Piled up）。細(xì)胞接觸匯合成片后，雖發(fā)生接觸抑制，只要營(yíng)養(yǎng)充分，細(xì)胞仍然能夠進(jìn)行增殖分裂，因此細(xì)胞數(shù)量仍在增多。但當(dāng)細(xì)胞密度進(jìn)一步增大，培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時(shí)，細(xì)胞因營(yíng)養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制（Density Inhibition），導(dǎo)致細(xì)胞分裂停止。因此細(xì)胞接觸抑制和密度抑制是兩個(gè)不同的概念，不應(yīng)混淆。
3．停滯期（Stagnate Phase）：
細(xì)胞數(shù)量達(dá)飽和密度后，細(xì)胞遂停止增殖，進(jìn)入停滯期。此時(shí)細(xì)胞數(shù)量不再增加，故也稱(chēng)平頂期（Plateau）。停滯期細(xì)胞雖不增殖，但仍有代謝活動(dòng)，繼而培養(yǎng)液中營(yíng)養(yǎng)漸趨耗盡，代謝產(chǎn)物積累、pH降低。此時(shí)需做分離培養(yǎng)即傳代，否則細(xì)胞會(huì)中毒，發(fā)生形態(tài)改變，重則從底物脫落死亡，故傳代應(yīng)越早越好。傳代過(guò)晚（已有中毒跡象）能影響下一代細(xì)胞的機(jī)能狀態(tài)。在這種情況下，雖進(jìn)行了傳代，因細(xì)胞已受損，需要恢復(fù)，至少還要再傳1～2兩代，通過(guò)換液淘汰掉死細(xì)胞和使受損輕微的細(xì)胞得以恢復(fù)后，才能再用。結(jié)果反而耽誤了時(shí)間，這是在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)特別注意的。

建立細(xì)胞系或細(xì)胞株

各種已被命名和經(jīng)過(guò)細(xì)胞生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系或細(xì)胞株，都是一些形態(tài)比較均一、生長(zhǎng)增殖比較穩(wěn)定的和生物性狀清楚的細(xì)胞群。因此凡符合上述情況的細(xì)胞群也可給以相應(yīng)的名稱(chēng)，即文獻(xiàn)中常稱(chēng)之為已鑒定的細(xì)胞（Certified Cells）。已鑒定的細(xì)胞可用于各種實(shí)驗(yàn)研究和生產(chǎn)生物制品。當(dāng)前世界上已建的各種細(xì)胞系（株）已難勝數(shù)，我國(guó)也建有百種以上，并在不斷增長(zhǎng)中。
一、體外培養(yǎng)細(xì)胞的種類(lèi)和命名
體外培養(yǎng)細(xì)胞的名稱(chēng)，隨培養(yǎng)細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展和細(xì)胞種類(lèi)的增多而演變。最早采用的名稱(chēng)為細(xì)胞株（Cell strain），以后又出現(xiàn)細(xì)胞系（Cell Line）一詞，兩者曾一度混用致概念不明確，導(dǎo)致文獻(xiàn)中也很混亂。我國(guó)也曾有類(lèi)似情況，在我國(guó)尚未制定出統(tǒng)一名詞前，本書(shū)用的名詞基本參考Schaeffer，W.I.（1979）和國(guó)內(nèi)有關(guān)會(huì)議、以及國(guó)內(nèi)外雜志常用名詞為準(zhǔn)。
（一）初代培養(yǎng)
初代培養(yǎng)又稱(chēng)原代培養(yǎng)，即直接從體內(nèi)取出的細(xì)胞、組織和器官進(jìn)行的第一次的培養(yǎng)物。一旦已進(jìn)行傳代培養(yǎng)（Subculture）的細(xì)胞，便不再稱(chēng)為初代培養(yǎng)，而改稱(chēng)為細(xì)胞系。
（二）細(xì)胞系
初代培養(yǎng)物開(kāi)始第一次傳代培養(yǎng)后的細(xì)胞，即稱(chēng)之為細(xì)胞系。如細(xì)胞系的生存期有限，則稱(chēng)之為有限細(xì)胞系（Finite Cell Line）；已獲無(wú)限繁殖能力能持續(xù)生存的細(xì)胞系，稱(chēng)連續(xù)細(xì)胞系或無(wú)限細(xì)胞系（Infinite Cell Line）。無(wú)限細(xì)胞系大多已發(fā)生異倍化，具異倍體核型，有的可能已成為惡性細(xì)胞，因此本質(zhì)上已是發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系。無(wú)限細(xì)胞系有的只有永生性（或不死性），但仍保留接觸抑制和無(wú)異體接種致癌性；有的不僅有永生性，異體接種也有致瘤性，說(shuō)明已惡性化。這兩種不同性質(zhì)的無(wú)限細(xì)胞系，在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中對(duì)這些名詞的應(yīng)用上也常不十分嚴(yán)格。為概念上的明確，本書(shū)中對(duì)有惡性的無(wú)限細(xì)胞系采用“惡性轉(zhuǎn)化細(xì)胞系”一詞表示可能更妥。而對(duì)那些只具永生性而無(wú)惡性的細(xì)胞系，則用無(wú)限細(xì)胞系或轉(zhuǎn)化細(xì)胞系即可。當(dāng)前流傳的NIH3T3、Rat-1、10T1/2等均屬這類(lèi)細(xì)胞系。
由某一細(xì)胞系分離出來(lái)的、在性狀上與原細(xì)胞系不同的細(xì)胞系，稱(chēng)該細(xì)胞系的亞系（Subline）。
（三）克隆細(xì)胞株
從一個(gè)經(jīng)過(guò)生物學(xué)鑒定的細(xì)胞系用單細(xì)胞分離培養(yǎng)或通過(guò)篩選的方法，由單細(xì)胞增殖形成的細(xì)胞群，稱(chēng)細(xì)胞株。再由原細(xì)胞株進(jìn)一步分離培養(yǎng)出與原株性狀不同的細(xì)胞群，亦可稱(chēng)之為亞株（Substrain）
（四）二倍體細(xì)胞
細(xì)胞群染色體數(shù)目具有與原供體二倍細(xì)胞染色體數(shù)相同或基本相同（2n細(xì)胞占75％或80％以上）的細(xì)胞群，稱(chēng)二倍體細(xì)胞培養(yǎng)。如僅數(shù)目相同，而核型不同的即染色體形態(tài)有改變者為假二倍體。二倍體細(xì)胞在正常情況下具有限生命期，故屬有限細(xì)胞系。但隨供體年齡和組織細(xì)胞的不同，二倍體細(xì)胞的壽命長(zhǎng)短各異。人胚肺成纖維細(xì)胞可傳50代土10代，人胚腎只有8～10代，人胚神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞15～30代；如從老齡個(gè)體取可傳50則細(xì)胞生存期更短。由不同年齡供體取材建立的二倍體細(xì)胞系可供研究衰老之用。為保持二倍體細(xì)胞能長(zhǎng)期被利用，一般在初代或2～5代即大量?jī)龃孀鳛樵�種（Stook Cells），用時(shí)再進(jìn)行繁殖，用后再繼續(xù)凍存，可供長(zhǎng)期使用或延緩細(xì)胞的衰老。
（五）遺傳缺陷細(xì)胞
從有先天遺傳缺陷者取材（主要為成纖維細(xì)胞）培養(yǎng)的細(xì)胞，或用人工方法誘發(fā)突變的細(xì)胞，都屬遺傳缺欠細(xì)胞。這類(lèi)細(xì)胞可能具有二倍體核型，也可呈異倍體。
（六）腫瘤細(xì)胞系或株
這是現(xiàn)有細(xì)胞系中最多的一類(lèi)，我國(guó)已建細(xì)胞系主要為這類(lèi)細(xì)胞。腫瘤細(xì)胞系多由癌瘤建成，多呈類(lèi)上皮型細(xì)胞，常已傳幾十代或百代以上，并具有不死性和異體接種致瘤性。
對(duì)已建成的各種細(xì)胞系或細(xì)胞株習(xí)慣上都給以名稱(chēng)；細(xì)胞的命名無(wú)嚴(yán)格統(tǒng)一規(guī)定，大多采用有一定意義縮寫(xiě)字或代號(hào)表示。但不論什么形式，均不宜太長(zhǎng)，以便記憶和了解，今別舉以下幾種代表性的細(xì)胞名稱(chēng)供參考：
HeLa：為供體患者的姓名（來(lái)源于宮頸癌）
CHO：中國(guó)地鼠卵巢細(xì)胞（Chinese Hamster Ovary）
宮-743：宮頸癌上皮細(xì)胞，1974年3月建立
NIH3T3：美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究所（National Institute of Health）建立；每3天傳代，每次接種3×105細(xì)胞／毫升。
二、建立細(xì)胞系（或株）的要求
關(guān)于什么樣的體外培養(yǎng)細(xì)胞群，可被確認(rèn)為是已被鑒定的細(xì)胞（Certified Cells），國(guó)際上也尚無(wú)統(tǒng)一的規(guī)定，一般依具體情況而定。在只用作初代培養(yǎng)細(xì)胞，只要供體性別、年齡等均一，取材部位及組織種類(lèi)等條件穩(wěn)定，做鑒定的項(xiàng)目無(wú)需很多，有幾項(xiàng)能說(shuō)明細(xì)胞的相關(guān)性狀的即可。如能長(zhǎng)期保存并可供其它研究室使用，特別是做反復(fù)傳代的細(xì)胞，習(xí)慣上有以下一些要求，并在刊物上報(bào)道時(shí)應(yīng)加以說(shuō)明。
（－）組織來(lái)源
應(yīng)說(shuō)明細(xì)胞供體所屬物種，來(lái)自人體，動(dòng)物或其它；供體的年齡、性別、取材的器官或組織；如系腫瘤組織，應(yīng)說(shuō)明臨床病理診斷，組織來(lái)源，以及病例號(hào)等。
（二）細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)
應(yīng)了解細(xì)胞一般和特殊的生物學(xué)性狀，如細(xì)胞的一般形態(tài)、特異結(jié)構(gòu)、細(xì)胞生長(zhǎng)曲線和分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、接種率；特異性，如為腺細(xì)胞有否特殊產(chǎn)物包括分泌蛋白或激素等；如為腫瘤細(xì)胞，應(yīng)力求證明細(xì)胞確系來(lái)源于原腫瘤組織而非其它，并仍保持性性，為此需做軟瓊脂培養(yǎng)、異體動(dòng)物接種致瘤性和對(duì)正常組織浸潤(rùn)力等實(shí)驗(yàn)。
（三）培養(yǎng)條件和方法
各種細(xì)胞都有自己比較適應(yīng)的生存環(huán)境，因此應(yīng)指明使用的培養(yǎng)基、血清種類(lèi)、用量以及細(xì)胞生存的適宜pH等。
三、已建立細(xì)胞系或株的鑒定、管理和使用
近些年，當(dāng)一個(gè)細(xì)胞系或細(xì)胞林建成后，我國(guó)常通過(guò)組織專(zhuān)家開(kāi)鑒定會(huì)的形式予以鑒定，從學(xué)術(shù)角度考慮，此舉實(shí)非必要。按國(guó)際慣例，只要研究認(rèn)真負(fù)責(zé)地把有關(guān)資料在雜志或刊物上報(bào)道，詳細(xì)介紹上述各項(xiàng)目即可。
以前因未建立統(tǒng)一的細(xì)胞庫(kù)時(shí)，對(duì)已建立的細(xì)胞系（株）多由作者單位自行保管，有浪費(fèi)人力、交流使用不便、細(xì)胞易污染和丟失等弊病。我國(guó)已初建成小規(guī)模貯存細(xì)胞機(jī)構(gòu)，待獲進(jìn)一步發(fā)展，這對(duì)我國(guó)細(xì)胞培養(yǎng)必將有更大促進(jìn)作用。
國(guó)際上美、英和日本等國(guó)已建有細(xì)胞庫(kù)；美國(guó)已有美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞庫(kù)或細(xì)胞銀行（ATCC）和人遺傳突變細(xì)胞庫(kù)（HGMR）、細(xì)胞衰老細(xì)胞庫(kù)（CAR）等，其中ATCC不僅是美國(guó)也世界最大的細(xì)胞庫(kù)。ATCC下屬有一組協(xié)作實(shí)驗(yàn)室和一個(gè)由眾多專(zhuān)家組成的咨詢(xún)委員會(huì)。ATCC也是美國(guó)國(guó)立癌癥研究所（NCI）和美國(guó)衛(wèi)生研究所中（NIH）的資源庫(kù)，尤與NCI有密切的關(guān)系。ATCC也是世界衛(wèi)生組織WHO的國(guó)際培養(yǎng)細(xì)胞文獻(xiàn)中心。ATCC現(xiàn)液氮凍存有3200個(gè)已經(jīng)過(guò)鑒定的細(xì)胞系（1992），其中包括來(lái)自正常人和各種疾病患者的皮膚成纖維細(xì)胞系；和來(lái)自不同物種的近75個(gè)雜交瘤細(xì)胞株。ATCC接納來(lái)自世界各國(guó)已經(jīng)鑒定的細(xì)胞予以貯存，同時(shí)也向世界各國(guó)的研究者或?qū)嶒?yàn)室免費(fèi)提供研究用細(xì)胞（做盈利性研究時(shí)收費(fèi)。） ATCC接納入庫(kù)細(xì)胞時(shí)，必須符合其入庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)， ATCC入庫(kù)細(xì)胞要求檢測(cè)項(xiàng)目如下：
培養(yǎng)簡(jiǎn)歷：組織來(lái)源日期、物種、組織起源、性別、年齡、供體正常或異常健康狀態(tài)、細(xì)胞已傳代數(shù)等
凍 存 液：培養(yǎng)基和防凍液名稱(chēng)
細(xì)胞活力：融解前后細(xì)胞接種存活率和生長(zhǎng)特性
培 養(yǎng) 液：培養(yǎng)基種類(lèi)和名稱(chēng)（一般要求不含抗生素）、血清來(lái)源和含量
細(xì)胞形態(tài)：類(lèi)型，如為上皮或成纖維細(xì)胞等，融解后細(xì)胞生長(zhǎng)特性
核 型：二倍體或多倍體，標(biāo)記染色體的有無(wú)
無(wú)污染檢測(cè)：包括細(xì)菌、真菌、支原體、原蟲(chóng)和病毒等
物種檢測(cè)：檢測(cè)同工酶，主要為G6PD和LDH，以證明細(xì)胞有否交叉污染以及反轉(zhuǎn)錄酶檢測(cè)
免疫檢測(cè)：一兩種血清學(xué)檢測(cè)
細(xì)胞建立者：建立者姓名；檢測(cè)者姓名
以上為ATCC入庫(kù)基本要求，雜交瘤入庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)尚有所不同，詳細(xì)情況請(qǐng)參閱ATCC的“Catalogue of Cell Lines and Hybridomas”