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個別組織細(xì)胞的培養(yǎng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-08
體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時,所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,現(xiàn)介紹個別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下:
一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)
上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中;祀s有成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細(xì)胞,并難以純化,同時上皮細(xì)胞難以在體外長期生存,因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)關(guān)鍵。
體內(nèi)上皮細(xì)胞生長在膠原構(gòu)成的基膜,因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長,另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)時,細(xì)胞易生長并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2 含量和溫度,向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子,均有利于表皮細(xì)胞生長。
以表皮細(xì)胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,其法如下(黑木凳志夫 1981)
1、取材:外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。
2、置0.02鞹A中,室溫,5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過夜。
4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。
5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。
6、反復(fù)吹打,制成懸液。
7、培養(yǎng):用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后,低速離心,吸去上清。
8、直接加入培養(yǎng)基(Eagle加20%小牛血清)制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)瓶,CO2溫箱培養(yǎng)。
二、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)
內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞,對于研究內(nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長因子(TAF)等有很大價值。
研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便,其法如下:
1、產(chǎn)后新鮮臍帶,無菌剪取10—15厘米長一段,如不能立即培養(yǎng),可于12小時內(nèi)保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。
4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復(fù))。5、離心去上清,加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)器皿中,置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見細(xì)胞長成單層。
三、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)
神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元〕不易培養(yǎng),只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時,可出現(xiàn)一定程度的分化,長出突起等現(xiàn)象,但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),不僅能獲得生長的膠質(zhì)細(xì)胞,也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說來,膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定,不易自發(fā)轉(zhuǎn)化,但對外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。
養(yǎng)方法如下:
1、從手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后,仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分,置Hanks液中漂洗一、二次。
2、置于30—50倍體積的Hanks液中,此時腦組織比較柔軟,反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。
3、把懸液注入離心管室溫中直立5—10分鐘后,細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉,脂肪等雜物易漂浮,可吸除上層、反復(fù)二、三次,即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。
4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液,通過紗網(wǎng)成紗布過濾,計數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。
5、接入培養(yǎng)瓶或皿中,置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。
該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過程較長,接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見細(xì)胞分裂現(xiàn)象,然而一旦生長后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。
四、肌組織培養(yǎng)
各種肌組織均可用于培養(yǎng),以心肌和骨骼肌較實(shí)用。
(-)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)
1、出生1一2天的乳鼠,引頸處死。
2、無菌取大腿肌組織,切成0.3一0.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無菌紗網(wǎng)或紗布濾過。
3、計數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。
4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。
5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。
該細(xì)胞接種率約50%,細(xì)胞生長開始呈紡錘形,培養(yǎng)50-52小時后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,此時可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。
(二)心肌細(xì)胞培養(yǎng)
心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料,Carrel曾長期培養(yǎng)過心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養(yǎng)和生長,可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好,原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,培養(yǎng)成功時,一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。
五、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)
巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養(yǎng),難以長期生存。
巨噬細(xì)胞也建有無限細(xì)胞系,大多來自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。
培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來源來獲取細(xì)胞,以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用,其法如下:
1、實(shí)驗(yàn)前三天,向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內(nèi)!),以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。
4、置動物于解剖臺,用針頭固定四肢,持鑷撕開腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側(cè),暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內(nèi)流動。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。
7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養(yǎng)基。
9、計數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞,其中90%為巨噬細(xì)胞。
10、以3×105個貼附細(xì)胞/平方厘米接種。
11、接種數(shù)小時后,除去培養(yǎng)液,可去除其它白細(xì)胞,純化培養(yǎng)細(xì)胞,用Eagle液沖洗1一2次,再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。
六、腎小球分離、移植培養(yǎng)
SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡1~2分鐘,2次,置超凈臺內(nèi),打開腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank’s液的無菌培養(yǎng)皿洗滌,置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng),濾過組織Hank’s液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),濾過,去小組織塊,濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng),輕輕濾過,Hank’s液洗滌1次,收集網(wǎng)上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應(yīng),離心除去膠原酶。處理過的腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,使腎小球大于60個/cm2,加培養(yǎng)基5~10ml(培養(yǎng)基組成:F12—3T3上清1:1;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養(yǎng)8~10天,去除腎小球未生長組分,細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時,形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞生長成單層多角型細(xì)胞,直徑約100μm。
七、裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)
無菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時,再加等體積0.2%胰酶消化5~8分鐘,在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞)來回推動注射器吹打組織以分離單細(xì)胞,終止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。
 

 

 
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