5.1. 微生物菌種保藏
在發(fā)酵工業(yè)中，具有良好性狀的生產(chǎn)菌種的獲得十分不容易，如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù)，使菌種經(jīng)長期保藏后不但存活健在，而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力，即很少發(fā)生突變，這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多，但原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔２�；干�?載體保藏或冷凍干燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔２?nbsp;
斜面?zhèn)鞔２胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng)，然后在低溫條件下保存。它可用于實驗室中各類微生物的保藏，此法簡單易行，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求最好在基本培養(yǎng)基上傳代，目的是能淘汰突變株，同時轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏，操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時，應(yīng)對需保藏的菌株預先作試驗，因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源，還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏，為了預防不測，一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當?shù)妮d體上，如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，制備方法為：將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機物，用水漂洗至中性，烘干，然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經(jīng)真空干燥8 h，于常溫或低溫下保藏均可，保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經(jīng)風干、粉碎，然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意，通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑；同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養(yǎng)物運輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)：將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存�；蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分別接到試管或指管內(nèi)，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù)：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù)：近年來，大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應(yīng)嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結(jié)點(通常為-30℃)。待細胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃／min，直到溫度達到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到最大穩(wěn)定期后，一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天，培養(yǎng)細菌約需24~28小時，培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為109~1019個/ml，取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養(yǎng)物干燥。最后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展，越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復制子很容易丟失。另外，對于宿主細胞質(zhì)粒基因通常為生長非必需，一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質(zhì)粒的細胞群體時極為有用。當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)。由此看來基因工程菌最好應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet，則培養(yǎng)時可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細胞。
5.1.9. 菌種保藏機構(gòu)
1979年7月，我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM),委托中國科學院負責全國菌種保藏管理業(yè)務(wù),并確定了與普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學、抗生素和獸醫(yī)等微生物學有關(guān)的六個菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應(yīng)用微生物各學科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應(yīng)和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經(jīng)濟建設(shè)、科學研究和教育事業(yè)服務(wù)。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統(tǒng):
中國微生物菌種保藏管理委員會辦事處：
中國科學院微生物研究所內(nèi)，北京。
1．普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)：
中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。
中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS—IV)： 病毒。
2．農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)：
中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)。
3．工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)：
中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所，北京(IFFI)。
4． 醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)：
中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京(ID)： 真菌。
衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌。
中國醫(yī)學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
5．抗生素菌種保藏管理中心(CACC)：
中國醫(yī)學科學院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工業(yè)研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)：生產(chǎn)用抗菌素菌種。
6． 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)：
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1．美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州，羅克維爾市。
2．冷泉港研究室(CSH)，美國。
3．國立衛(wèi)生研究院(NIH)，美國，馬里蘭州，貝塞斯達。
4．美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部(NRRL)，美國，皮奧里亞市。
5．威斯康新大學，細菌學系（WB）,美國，威斯康新州馬迪孫。
6．國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國，倫敦。
7．英聯(lián)邦真菌研究所(CMI)，英國，丘(園)。
8．荷蘭真菌中心收藏所(CBS)，荷蘭，巴爾恩市。
9．日本東京大學應(yīng)用微生物研究所(IAM)，日本，東京。
10. 發(fā)酵研究所(IFO)，日本，大阪。．
11．日本北海道大學農(nóng)業(yè)部(AHU)， 日本，北海道扎幌市。
12. 科研化學有限公司(KCC)，日本，東京。
13．國立血清研究所(SSI)，丹麥。
14．世界衛(wèi)生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復壯
5.2.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變（自發(fā)突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動等。所有這些，只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中，最易覺察到的是菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現(xiàn)等；菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去，必須做好菌種的復壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。當控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，就會引起產(chǎn)量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細胞應(yīng)使用單核的，避免使用多核細胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理后進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的，當培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產(chǎn)實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當?shù)囊品N傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現(xiàn)，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以達到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進行選種的工作。具體的菌種的復壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復原菌株性狀。
通過寄主進行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進行復壯。
在發(fā)酵工業(yè)中，具有良好性狀的生產(chǎn)菌種的獲得十分不容易，如何利用優(yōu)良的微生物菌種保藏技術(shù)，使菌種經(jīng)長期保藏后不但存活健在，而且保證高產(chǎn)突變株不改變表型和基因型，特別是不改變初級代謝產(chǎn)物和次級代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的高產(chǎn)能力，即很少發(fā)生突變，這對于菌種極為重要。
微生物菌種保藏技術(shù)很多，但原理基本一致，即采用低溫、干燥、缺氧、缺乏營養(yǎng)、添加保護劑或酸度中和劑等方法，挑選優(yōu)良純種，最好是它們的休眠體，使微生物生長在代謝不活潑，生長受抑制的環(huán)境中。具體常用的方法有：蒸餾水懸浮或斜面?zhèn)鞔２�；干�?載體保藏或冷凍干燥保藏；超低溫或在液氮中冷凍保藏等方法。
5.1.1. 蒸餾水懸浮法
這是一種最簡單的菌種保藏方法，只要將菌種懸浮于無菌蒸餾水中，將容器封好口，于10℃保藏即可達到目的。好氣性細菌和酵母等可用此法保存。
5.1.2. 斜面?zhèn)鞔２?nbsp;
斜面?zhèn)鞔２胤椒ㄊ菍⒕N定期在新鮮瓊脂斜面培養(yǎng)基上、液體培養(yǎng)基中或穿刺培養(yǎng)，然后在低溫條件下保存。它可用于實驗室中各類微生物的保藏，此法簡單易行，且不要求任何特殊的設(shè)備。但此方法易發(fā)生培養(yǎng)基干枯、菌體自溶、基因突變、菌種退化、菌株污染等不良現(xiàn)象。因此要求最好在基本培養(yǎng)基上傳代，目的是能淘汰突變株，同時轉(zhuǎn)接菌量應(yīng)保持較低水平。斜面培養(yǎng)物應(yīng)在密閉容器中于5℃保藏，以防止培養(yǎng)基脫水并降低代謝活性。此方法一般不適宜作工業(yè)生產(chǎn)菌種的長期保藏，一般保存時間為3~6個月。如放線菌于4~6℃保存，每3個月移接一次；酵母菌于4~6℃保存，每4~6個月移接一次；霉菌于4~6℃保存，每6個月移接一次。
5.1.3. 礦物油中浸沒保藏
此方法簡便有效，可用于絲狀真菌、酵母、細菌和放線菌的保藏。特別對難于冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔子菌等的保藏更為有效。是將瓊脂斜面或液體培養(yǎng)物或穿刺培養(yǎng)物浸入礦物油中于室溫下或冰箱中保藏，操作要點是首先讓待保藏菌種在適宜的培養(yǎng)基上生長，然后注入經(jīng)160℃干熱滅菌1~2h或濕熱滅菌后120℃烘去水分的礦物油，礦物油的用量以高出培養(yǎng)物1cm為宜，并以橡皮塞代替棉塞封口，這樣可使菌種保藏時間延長至1~2年。以液體石蠟作為保藏方法時，應(yīng)對需保藏的菌株預先作試驗，因為某些菌株如酵母、霉菌、細菌等能利用石蠟為碳源，還有些菌株對液體石蠟保藏敏感。所有這些菌株都不能用液體石蠟保藏，為了預防不測，一般保藏菌株 2~3年也應(yīng)做一次存活試驗。
5.1.4. 干燥-載體保藏
此法適用于產(chǎn)孢子或芽孢的微生物的保藏。是將菌種接種于適當?shù)妮d體上，如河砂、土壤、硅膠、濾紙及麩皮等，以保藏菌種。以沙土保藏用得較多，制備方法為：將河砂經(jīng)24目過篩后用10%~20%鹽酸浸泡3~4 h，以除去其中所含的有機物，用水漂洗至中性，烘干，然后裝入高度約1cm的河沙于小試管中，121℃間歇滅菌3次。用無菌吸管將孢子懸液滴入砂粒小管中，經(jīng)真空干燥8 h，于常溫或低溫下保藏均可，保存期為1~10年。土壤法以土壤代替砂粒，不需酸洗，經(jīng)風干、粉碎，然后同法過篩、滅菌即可。一般細菌芽孢常用砂管保藏，霉菌的孢子多用麩皮管保藏。
5.1.5. 冷凍保藏
冷凍保藏是指將菌種于-20℃以下的溫度保藏， 冷凍保藏為微生物菌種保藏非常有效的方法。通過冷凍，使微生物代謝活動停止。一般而言，冷凍溫度愈低，效果愈好。為了保藏的結(jié)果更加令人滿意，通常在培養(yǎng)物中加入一定的冷凍保護劑；同時還要認真掌握好冷凍速度和解凍速度。冷凍保藏的缺點是培養(yǎng)物運輸較困難。
普通冷凍保藏技術(shù)(-20℃)：將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，于冰箱的冷藏室中貯藏，或于溫度范圍在-5~20℃的普通冰箱中保存�；蛘邔⒁后w培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分別接到試管或指管內(nèi)，嚴格密封后，同上置于冰箱中保存。用此方法可以維持若干微生物的活力 1~2年。應(yīng)注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。
超低溫冷凍保藏技術(shù)：要求長期保藏的微生物菌種，一般都應(yīng)在-60℃以下的超低溫冷藏柜中進行保藏。超低溫冷凍保藏的一般方法是：先離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞，再用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞，然后加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜冷凍保護劑，混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于-70℃超低溫冰箱中保藏。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1~2℃/ min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。
液氮冷凍保藏技術(shù)：近年來，大量有特殊意義和特征的高等動、植物細胞能夠在液氮中長期保藏，并發(fā)現(xiàn)在液氮中保藏的菌種的存活率遠比其他保藏方法高且回復突變的發(fā)生率極低。液氮保藏巳成為工業(yè)微生物菌種保藏的最好方法。具體方法是：把細胞懸浮于一定的分散劑中或是把在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)好的菌種直接進行液體冷凍，然后移至液氮(-196℃)或其蒸汽相中(-l56℃)保藏。進行液氮冷凍保藏時應(yīng)嚴格控制致冷速度。液氮冷凍保藏微生物菌種的步驟是先制備冷凍保藏菌種的細胞懸液，分裝0.5~1ml入玻璃安瓿或液氮冷藏專用塑料瓶，玻璃安瓿用酒精噴燈封口。然后以1.2℃／min的致冷速度降溫，直到溫度達到相對溫度之上幾度的細胞凍結(jié)點(通常為-30℃)。待細胞凍結(jié)后，將致冷速度降為1℃／min，直到溫度達到-50℃，將安瓿迅速移入液氮罐中于液相(-196℃)或氣相 (-156℃)中保存。如果無控速冷凍機，則一般可用如下方法代替：將安瓿或液氮瓶置于-70℃冰箱中冷凍4h，然后迅速移入液氮罐中保存。在液氮冷凍保藏中，最常用的冷凍保護劑是二甲亞砜和甘油，最終使用濃度一般為甘油10％、二甲亞砜5％。所使用的甘油一般用高壓蒸汽滅菌，而二甲亞砜最好為過濾滅菌。
5.1.6. 真空凍干保藏
真空冷凍干燥的基本方法是先將菌種培養(yǎng)到最大穩(wěn)定期后，一般培養(yǎng)放線菌和絲狀真菌約需7~10天，培養(yǎng)細菌約需24~28小時，培養(yǎng)酵母約需3天。然后混懸于含有保護劑的溶液中，保護劑常選用脫脂乳、蔗糖、動物血清、谷氨酸鈉等，菌液濃度為109~1019個/ml，取0.1~0.2ml菌懸液置于安瓿管中冷凍，再于減壓條件下使凍結(jié)的細胞懸液中的水分升華至1%~5%，使培養(yǎng)物干燥。最后將管口熔封，保存在常溫下或冰箱中。此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一，大部分微生物菌種可以在凍干狀態(tài)下保藏10年之久而不喪失活力。而且經(jīng)凍干后的菌株無需進行冷凍保藏，便于運輸。但操作過程復雜，并要求一定的設(shè)備條件。
5.1.7. 寄主保藏
適用于一些難于用常規(guī)方法保藏的動植物病原菌和病毒。
5.1.8. 基因工程菌的保藏
隨著基因工程的不斷發(fā)展，越來越多的基因工程菌需要得到合理的保藏，由于它們的載體質(zhì)粒等所攜帶的外源DNA片段的遺傳性狀不太穩(wěn)定、且其外源質(zhì)粒復制子很容易丟失。另外，對于宿主細胞質(zhì)粒基因通常為生長非必需，一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。而由質(zhì)粒編碼的抗生素抗性在富集含此類質(zhì)粒的細胞群體時極為有用。當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極有用的生長選擇壓。而且在運用基因工程菌進行發(fā)酵時，抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)。由此看來基因工程菌最好應(yīng)保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。例如，質(zhì)粒pBR322。它除了能將外源DNA 輸入E．coli細胞外，還賦予E．coli細胞Ampr和Tetr。如果在培養(yǎng)基中加入Amp和Tet，則培養(yǎng)時可選擇出含pBR322質(zhì)粒的細胞。
5.1.9. 菌種保藏機構(gòu)
1979年7月，我國成立了中國微生物菌種保藏管理委員會(CCCCM),委托中國科學院負責全國菌種保藏管理業(yè)務(wù),并確定了與普通、農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)學、抗生素和獸醫(yī)等微生物學有關(guān)的六個菌種保藏管理中心。各保藏管理中心從事應(yīng)用微生物各學科的微生物菌種的收集、保藏、管理、供應(yīng)和交流。以便更好地利用微生物資源為我國的經(jīng)濟建設(shè)、科學研究和教育事業(yè)服務(wù)。
(一)中國微生物菌種保藏管理委員會組織系統(tǒng):
中國微生物菌種保藏管理委員會辦事處：
中國科學院微生物研究所內(nèi)，北京。
1．普通微生物菌種保藏管理中心(CCGMC)：
中國科學院微生物研究所，北京(AS)：真菌、細菌。
中國科學院武漢病毒研究所，武漢(AS—IV)： 病毒。
2．農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心(ACCC)：
中國農(nóng)業(yè)科學院土壤肥料研究所，北京(ISF)。
3．工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)：
中國食品發(fā)酵工業(yè)科學研究所，北京(IFFI)。
4． 醫(yī)學微生物菌種保藏管理中心(CMCC)：
中國醫(yī)學科學院皮膚病研究所，南京(ID)： 真菌。
衛(wèi)生部藥品生物制品鑒定所，北京(NICPBP)：細菌。
中國醫(yī)學科學院病毒研究所，北京(IV)：病毒。
5．抗生素菌種保藏管理中心(CACC)：
中國醫(yī)學科學院抗菌素研究所，北京(IA)和四川抗菌素工業(yè)研究所，成都(SIA)：新抗菌素菌種。
華北制藥廠抗菌素研究所，石家莊(IANP)：生產(chǎn)用抗菌素菌種。
6． 獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心(CVCC)：
農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京(CIVBP)。
(二)國外著名菌種保藏中心
1．美國標準菌種收藏所(ATCC)，美國馬里蘭州，羅克維爾市。
2．冷泉港研究室(CSH)，美國。
3．國立衛(wèi)生研究院(NIH)，美國，馬里蘭州，貝塞斯達。
4．美國農(nóng)業(yè)部北方開發(fā)利用研究部(NRRL)，美國，皮奧里亞市。
5．威斯康新大學，細菌學系（WB）,美國，威斯康新州馬迪孫。
6．國立標準菌種收藏所(NCTC)，英國，倫敦。
7．英聯(lián)邦真菌研究所(CMI)，英國，丘(園)。
8．荷蘭真菌中心收藏所(CBS)，荷蘭，巴爾恩市。
9．日本東京大學應(yīng)用微生物研究所(IAM)，日本，東京。
10. 發(fā)酵研究所(IFO)，日本，大阪。．
11．日本北海道大學農(nóng)業(yè)部(AHU)， 日本，北海道扎幌市。
12. 科研化學有限公司(KCC)，日本，東京。
13．國立血清研究所(SSI)，丹麥。
14．世界衛(wèi)生組織(WHO)。
5.2. 菌種的退化與復壯
5.2.1. 菌種的退化現(xiàn)象
隨著菌種保藏時間的延長或菌種的多次轉(zhuǎn)接傳代，菌種本身所具有的優(yōu)良的遺傳性狀可能得到延續(xù)，也可能發(fā)生變異。變異有正變（自發(fā)突變）和負變兩種，其中負變即菌株生產(chǎn)性狀的劣化或有些遺傳標記的丟失均稱為菌種的退化。但是在生產(chǎn)實踐中，必須將由于培養(yǎng)條件的改變導致菌種形態(tài)和生理上的變異與菌種退化區(qū)別開來。因為優(yōu)良菌株的生產(chǎn)性能是和發(fā)酵工藝條件緊密相關(guān)的。如果培養(yǎng)條件發(fā)生變化，如培養(yǎng)基中缺乏某些元素，會導致產(chǎn)孢子數(shù)量減少，也會引起孢子顏色的改變；溫度、pH值的變化也會使發(fā)酵產(chǎn)量發(fā)生波動等。所有這些，只要條件恢復正常，菌種原有性能就能恢復正常，因此這些原因引起的菌種變化不能稱為菌種退化。常見的菌種退化現(xiàn)象中，最易覺察到的是菌落形態(tài)、細胞形態(tài)和生理等多方面的改變，如菌落顏色的改變，畸形細胞的出現(xiàn)等；菌株生長變得緩慢，產(chǎn)孢子越來越少直至產(chǎn)孢子能力喪失，例如放線菌、霉菌在斜面上多次傳代后產(chǎn)生“光禿”現(xiàn)象等，從而造成生產(chǎn)上用孢子接種的困難；還有菌種的代謝活動，代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)能力或其對寄主的寄生能力明顯下降，例如黑曲霉糖化能力的下降，抗菌素發(fā)酵單位的減少，枯草桿菌產(chǎn)淀粉酶能力的衰退等。所有這些都對發(fā)酵生產(chǎn)均不利。因此，為了使菌種的優(yōu)良性狀持久延續(xù)下去，必須做好菌種的復壯工作。即在各菌種的優(yōu)良性狀沒有退化之前，定期進行純種分離和性能測定。
5.2.2. 菌種退化的原因
菌種退化的主要原因是有關(guān)基因的負突變。當控制產(chǎn)量的基因發(fā)生負突變，就會引起產(chǎn)量下降；當控制孢子生成的基因發(fā)生負突變，則使菌種產(chǎn)孢子性能下降。一般而言，菌種的退化是一個從量變到質(zhì)變的逐步演變過程。開始時，在群體中只有個別細胞發(fā)生負突變，這時如不及時發(fā)現(xiàn)并采用有效措施而一味移種傳代，就會造成群體中負突變個體的比例逐漸增高，最后占優(yōu)勢，從而使整個群體表現(xiàn)出嚴重的退化現(xiàn)象。因此，突變在數(shù)量上的表現(xiàn)依賴于傳代，即菌株處于一定條件下，群體多次繁殖，可使退化細胞在數(shù)量上逐漸占優(yōu)勢，于是退化性狀的表現(xiàn)就更加明顯，逐漸成為一株退化了的菌體。同時，對某一菌株的特定基因來講，突變頻率比較低，因此群體中個體發(fā)生生產(chǎn)性能的突變不是很容易的，但就一個經(jīng)常處于旺盛生長狀態(tài)的細胞而言，發(fā)生突變的機率比處于休眠狀態(tài)的細胞大得多，因此，細胞的代謝水平與基因突變關(guān)系密切，應(yīng)設(shè)法控制細胞保藏的環(huán)境，使細胞處于休眠狀態(tài)，從而減少菌種的退化。
5.2.3. 防止退化的措施
合理的育種 選育菌種時所處理的細胞應(yīng)使用單核的，避免使用多核細胞；
合理選擇誘變劑的種類和劑量或增加突變位點，以減少分離回復；在誘變處理后進行充分的后培養(yǎng)及分離純化，以保證保藏菌種純碎。這些可有效的防止菌種的退化。
選用合適的培養(yǎng)基 有人發(fā)現(xiàn)用老苜蓿根汁培養(yǎng)基培養(yǎng)“5406”抗生菌—細黃鏈霉菌可以防止它的退化。在赤霉菌產(chǎn)生菌—藤倉赤霉的培養(yǎng)基中，加入糖蜜、天門冬素、谷氨酰胺、5-核苷酸或甘露醇等物質(zhì)時，也有防止菌種退化的效果。也有選取營養(yǎng)相對貧乏的培養(yǎng)基做菌種保藏培養(yǎng)基，如培養(yǎng)基中適當限制容易利用的糖源葡萄糖等的添加，因為變異多半是通過菌株的生長繁殖而產(chǎn)生的，當培養(yǎng)基營養(yǎng)豐富時，菌株會處于旺盛的生長狀態(tài)，代謝水平較高，為變異提供了良好的條件，大大提高了菌株的退化幾率。
創(chuàng)造良好的培養(yǎng)條件 在生產(chǎn)實踐中，創(chuàng)造和發(fā)現(xiàn)一個適合原種生長的條件可以防止菌種退化，如低溫、干燥、缺氧等。在棲土曲霉3．942 的培養(yǎng)中，有人曾用改變培養(yǎng)溫度的措施(從20-30℃提高到33-34℃)來防止它產(chǎn)孢子能力的退化。
控制傳代次數(shù) 由于微生物存在著自發(fā)突變，而突變都是在繁殖過程中發(fā)生而表現(xiàn)出來的。所以應(yīng)盡量避免不必要的移種和傳代，把必要的傳代降低到最低水平，以降低自發(fā)突發(fā)的機率。菌種傳代次數(shù)越多，產(chǎn)生突變的幾率就越高，因而菌種發(fā)生退化的機會就越多。這要求不論在實驗室還是在生產(chǎn)實踐上，必須嚴格控制菌種的移種傳代次數(shù)，并根據(jù)菌種保藏方法的不同，確立恰當?shù)囊品N傳代的時間間隔。如同時采用斜面保藏和其它的保藏方式（真空凍干保藏、砂土管、液氮保藏等），以延長菌種保藏時間。
利用不同類型的細胞進行移種傳代 在有些微生物中，如放線菌和霉菌，由于其菌的細胞常含有幾個核或甚至是異核體，因此用菌絲接種就會出現(xiàn)不純和衰退，而孢子一般是單核的，用它接種時，就沒有這種現(xiàn)象發(fā)生。有人在實踐中發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉如用分生孢子傳代就容易退化，而改用子囊孢子移種傳代則不易退化；還有人采用滅過菌的棉團輕巧地沾取“5406”孢子進行斜面移種，由于避免了菌絲的接入，因而達到了防止退化的效果。
采用有效的菌種保藏方法 用于工業(yè)生產(chǎn)的一些微生物菌種，其主要性狀都屬于數(shù)量性狀，而這類性狀恰是最容易退化的。因此，有必要研究和制定出更有效的菌種保藏方法以防止菌種退化。
5.2.4. 退化菌種的復壯
退化菌種的復壯可通過純種分離和性能測定等方法來實現(xiàn)，其中一種是從退化菌種的群體中找出少數(shù)尚未退化的個體，以達到恢復菌種的原有典型性狀。另一種是在菌種的生產(chǎn)性能尚未退化前就經(jīng)常而有意識地進行純種分離和生產(chǎn)性能的測定工作，以達到菌種的生產(chǎn)性能逐步有所提高。所以這實際上是一種利用自發(fā)突變不斷從生產(chǎn)中進行選種的工作。具體的菌種的復壯措施如下：
純種分離 采用平板劃線分離法、稀釋平板法或涂布法均可。把仍保持原有典型優(yōu)良性狀的單細胞分離出來，經(jīng)擴大培養(yǎng)恢復原菌株的典型優(yōu)良性狀，若能進行性能測定則更好。還可用顯微鏡操縱器將生長良好的單細胞或單孢子分離出來，經(jīng)培養(yǎng)恢復原菌株性狀。
通過寄主進行復壯 寄生型微生物的退化菌株可接種到相應(yīng)寄主體內(nèi)以提高菌株的活力。
聯(lián)合復壯 對退化菌株還可用高劑量的紫外線輻射和低劑量的DTG聯(lián)合處理進行復壯。