1.1. 遺傳和變異的物質(zhì)基礎(chǔ)
20世紀(jì)50年代以前，許多學(xué)者認(rèn)為蛋白質(zhì)對(duì)于遺傳變異起著決定性的作用，而通過(guò)對(duì)高等動(dòng)物和植物染色體的化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)染色體由核酸和蛋白質(zhì)，并且主要是脫氧核糖核酸（DNA）組成。因此，要回答究竟是蛋白質(zhì)還是核酸對(duì)于遺傳變異起著決定性的作用，經(jīng)研究，人們認(rèn)識(shí)到以微生物為研究材料具有特殊的優(yōu)越性，于是通過(guò)以下三個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)，充分證明了遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸。
1.1.1. 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)（DNA片段），將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀，這種變異現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。
肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由英國(guó)的細(xì)菌學(xué)家格里菲斯(Griffith)于1928年發(fā)現(xiàn)的。肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)是一種病原菌，存在著光滑型(Smooth簡(jiǎn)稱S型)和粗糙型(Rough簡(jiǎn)稱R型) 兩種不同類型。其中光滑型的菌株產(chǎn)生莢膜，有毒，在人體內(nèi)它導(dǎo)致肺炎，在小鼠體中它導(dǎo)致敗血癥，并使小鼠患病死亡，其菌落是光滑的；粗糙型的菌株不產(chǎn)生莢膜，無(wú)毒，在人或動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)導(dǎo)致病害，其菌落是粗糙的。格里菲斯以R型和S型菌株作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，他將活的、無(wú)毒的RⅡ型（無(wú)莢膜，菌落粗糙型）肺炎雙球菌或加熱殺死的有毒的SⅢ型肺炎雙球菌注入小白鼠體內(nèi)，結(jié)果小白鼠安然無(wú)恙；將活的、有毒的SⅢ型（有莢膜，菌落光滑型）肺炎雙球菌或?qū)⒋罅拷?jīng)加熱殺死的有毒的SⅢ型肺炎雙球菌和少量無(wú)毒、活的RⅡ型肺炎雙球菌混合后分別注射到小白鼠體 內(nèi)，結(jié)果小白鼠患病死亡，并從小白鼠體內(nèi)分離出活的SⅢ型菌。格里菲斯稱這一現(xiàn)象為轉(zhuǎn)化作用(圖5－1)，實(shí)驗(yàn)表明，SⅢ型死菌體內(nèi)有一種物質(zhì)能引起RⅡ型活菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SⅢ型菌，這種轉(zhuǎn)化的物質(zhì)（轉(zhuǎn)化因子）是什么?格里菲斯對(duì)此并未做出回答。1944年美國(guó)的埃弗雷(O．Avery)、麥克利奧特(C. Macleod)及麥克卡蒂(M．Mccarty)等人在格里菲斯工作的基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)化的本質(zhì)進(jìn)行了深入的研究。他們從SⅢ型活菌體內(nèi)提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)和莢膜多糖，將它們分別和 RⅡ型活菌混合均勻后注射人小白鼠體內(nèi)，結(jié)果只有注射SⅢ型菌DNA和RⅡ型活菌的混合液的小白鼠才死亡，這是一部分 RⅡ型菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有毒的、有莢膜的SⅢ型菌所致，并且它們的后代都是有毒、有莢膜的。由此說(shuō)明RNA、蛋白質(zhì)和莢膜多糖均不引起轉(zhuǎn)化，而DNA卻能引起轉(zhuǎn)化。如果用DNA酶處理DNA后，則轉(zhuǎn)化作用喪失。
圖5－1. 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象
1.1.2. 噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)
證明DNA是遺傳物質(zhì)，還可用T2噬菌體感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。1952年赫西(A．Hershey)和蔡斯(M．Chase)用32P043-和35S042-標(biāo)記T2噬菌體，因DNA分子中只含磷不含硫，而蛋白質(zhì)分子中只含硫不含磷。故將T2噬菌體的頭部DNA標(biāo)上32P，其蛋白質(zhì)衣殼被標(biāo)上35S。用標(biāo)上32P和35S的T2噬菌體感染大腸桿菌，經(jīng)短時(shí)間的保溫后，T2噬菌體完成了吸附和侵入的過(guò)程。將被感染的大腸桿菌洗凈放入組織搗碎器內(nèi)強(qiáng)烈攪拌，然后離心沉淀。分別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記，結(jié)果全部35S和噬菌體在上清液中，全部32P和細(xì)菌聚集在沉淀物中。這說(shuō)明在感染過(guò)程中 噬菌體的DNA進(jìn)人大腸桿菌細(xì)胞中，它的蛋白質(zhì)外殼留在菌體外。進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)的T2噬菌體DNA，利用大腸桿菌體內(nèi)的DNA、酶及核糖體復(fù)制大量T2噬菌體，又一次證明了DNA是遺傳物質(zhì)(圖5－2)。
1.1.3. 煙草花葉病毒的拆開與重建實(shí)驗(yàn)
煙草花葉病毒(TMV)由蛋白質(zhì)外殼和核糖核酸 （RNA）核心所構(gòu)成，可以從TMV病毒分別抽提得到它的蛋白質(zhì)部分和RNA部分，把這兩個(gè)部分放在一起，可以得到具有感染能力的煙草花葉病毒顆粒。1965年，美國(guó)的法朗克一康勒特(Fraenkel Conrat)將煙草花葉病毒拆成蛋白質(zhì)和RNA(該病毒不含DNA)，分別對(duì)煙草進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具有蛋白質(zhì)外殼和RNA核心的煙草花葉病毒。煙草花葉病毒有不同的變種，各個(gè)變種的蛋白質(zhì)的氨基酸組成有細(xì)微而明顯的區(qū)別，后來(lái)法朗克一康勒特又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開，在體外分別將甲病毒的蛋白質(zhì)和乙病毒的RNA結(jié)合，將甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行重建，并用這些經(jīng)過(guò)重建的雜種病毒分別感染煙草，結(jié)果從寄主分離所得的病毒蛋白質(zhì)均取決于相應(yīng)病毒的RNA(圖5－3)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明病毒蛋白質(zhì)的特性由它的核酸(RNA)所決定，而不是由蛋白質(zhì)所決定�？梢娫谶@里同樣證明了核酸(RNA)仍然是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)。
圖5－2. T2噬菌體感染試驗(yàn)示意圖
到目前為止，發(fā)現(xiàn)只有一部分病毒（包括動(dòng)物、植物病毒和噬菌體）的遺傳物質(zhì)是RNA，其他生物的遺傳物質(zhì)都是DNA。
圖5－3. 病毒重組實(shí)驗(yàn)示意圖
1.2. DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制
1.2.1. DNA的結(jié)構(gòu)
現(xiàn)在我們已經(jīng)知道，DNA是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，那么，DNA為什么能起遺傳作用，它又是怎么起作用的呢？這與它的分子結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)的。
DNA又稱脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid),是一種高分子化合物，其基本單位是脫氧核苷酸,相對(duì)分子質(zhì)量最小的為2.3×104，最大的達(dá)1×1010，比蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(5×103~5×106)大。沃森(Watson)和克里克(Crick) 于1953年由X射線衍射結(jié)構(gòu)分析提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)理論和模型，認(rèn)為DNA是由兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構(gòu)成的右手螺旋結(jié)構(gòu). (圖5—5)。多核苷酸的方向由核苷酸間的磷酸二酯鍵的走向決定,一條從5’到3’，另一條從3’到 5’。鏈間有螺旋型的凹槽，其中一條較淺，叫小溝；另一條較深，叫大溝。每條多核苷酸鏈上均有四種堿基：A(腺嘌呤adenine)、T(胸腺嘧啶thymine)、C (胞嘧啶cytosine)、G(鳥嘌呤guanine)有序地排列，它們以氫鍵與另一條多核苷酸鏈的四種堿基相連,A與T配對(duì),C與G配對(duì)，這種由氫鍵連接的堿基組合，稱堿基配對(duì)(圖5－4)。一個(gè)DNA分子可含幾十萬(wàn)或幾百萬(wàn)堿基對(duì)，相鄰堿基對(duì)平面之間的距離為0.34nm，即順中心軸方向,每隔0.34nm有一個(gè)核苷酸,以3.4nm為一個(gè)結(jié)構(gòu)重復(fù)周期，包括10對(duì)堿基。核苷酸的磷酸基與脫氧核糖在外側(cè)，通過(guò)磷酸二酯鍵相連接而構(gòu)成DNA分子的骨架。脫氧核酸環(huán)平面與縱軸大致平行，雙螺旋的直徑為2.0nm。
圖5－4. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基配對(duì)示意圖
此模型所描述的資料來(lái)自在相對(duì)濕度為92％時(shí)所得到的DNA鈉鹽纖維，這種DNA稱為B型DNA（B-DNA），B-DNA雙螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)既規(guī)則又很穩(wěn)定，但不是絕對(duì)的，它在環(huán)境中不停地運(yùn)動(dòng)，如室溫下DNA溶液中有部分氫鍵會(huì)斷開，造成這些部位結(jié)構(gòu)多變。水溶液及細(xì)胞中天然狀態(tài)DNA大多為B-DNA，但若濕度改變或由DNA鈉鹽變?yōu)殁淃}、銫鹽等則會(huì)引起構(gòu)象的變化，形成A-DNA、C-DNA等構(gòu)象。此外還有Z-DNA, Z-DNA結(jié)構(gòu)是1979年由Rich提出的(圖5－5)，該模型的提出曾一度動(dòng)搖過(guò)右手螺旋學(xué)說(shuō)�，F(xiàn)已證明，左手螺旋Z-DNA只是右手螺旋結(jié)構(gòu)模型的一個(gè)補(bǔ)充和發(fā)展。B-DNA是活性最高的DNA構(gòu)象，B-DNA變構(gòu)成A-DNA后，仍有活性，但若局部變構(gòu)為Z-DNA后活性明顯降低。
圖5－5. 兩種不同形式的DNA
DNA除了具有右旋、左旋的雙股螺旋結(jié)構(gòu)外，后來(lái)科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成了三股螺旋的DNA（圖5－6），它由15－25個(gè)核苷酸組成的短鏈反義核酸綁到雙股DNA中形成。1992年我國(guó)科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)具有三股螺旋的天然DNA�，F(xiàn)三股螺旋的DNA的存在已被國(guó)際公認(rèn)。
圖5－6. 三股螺旋結(jié)構(gòu)的DNA
一般而言，特定的種或菌株的DNA分子，其堿基順序固定不變，這保證了遺傳的穩(wěn)定性。如果DNA的個(gè)別部位發(fā)生了堿基排列順序的變化，則會(huì)導(dǎo)致菌株死亡或發(fā)生遺傳性狀的改變。在現(xiàn)代細(xì)菌分類鑒定中，通過(guò)測(cè)定G十C百分含量確定屬、種或菌株。
基因是一切生物體內(nèi)儲(chǔ)存遺傳信息的、有自我復(fù)制能力的遺傳功能單位。它是DNA分子上一個(gè)具有特定堿基順序，即核苷酸順序的片斷。按功能可分三種：第一種是結(jié)構(gòu)基因，編碼蛋白質(zhì)或酶的結(jié)構(gòu)，控制某種蛋白質(zhì)或酶的合成。但tRNA和rRNA基因不編碼蛋白質(zhì)。第二種是操縱區(qū)，它的功能像“開關(guān)”，操縱三個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第三種是調(diào)節(jié)基因，它控制結(jié)構(gòu)基因。例如：大腸桿菌三種有關(guān)利用乳糖的酶是由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因決定的。先由調(diào)節(jié)基因決定一種阻抑蛋白封閉操縱區(qū)的作用，使三個(gè)結(jié)構(gòu)基因都不能表達(dá)，阻抑了酶的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖時(shí)阻抑蛋白失活，不能封閉操縱區(qū)，因而結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)，合成能利用乳糖的酶。
一個(gè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量大約為6×l05，約有1000個(gè)堿基對(duì)，每個(gè)細(xì)菌約具有5000至10000個(gè)基因�；蚩刂七z傳性狀，但不等于遺傳性狀。任何一個(gè)遺傳性狀的表現(xiàn)都是在基因控制下的個(gè)體發(fā)育的結(jié)果。從基因型到表現(xiàn)型必須通過(guò)酶催化的代謝活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)�；蛑苯涌刂泼傅暮铣桑纯刂埔粋�(gè)生化步驟，控制新陳代謝，從而決定了遺傳性狀的表現(xiàn)。
1.2.2. DNA的復(fù)制
菌株細(xì)胞在分裂之前，只有DNA十分精確地進(jìn)行復(fù)制，才能保證微生物的所有屬性都得到遺。而DNA的獨(dú)特的半保留式的自我復(fù)制能力，確保了DNA復(fù)制的精確性，并保證了一切生物遺傳性的相對(duì)穩(wěn)定。DNA的自我復(fù)制大致如下：首先是DNA分子中的兩條多核苷酸鏈之間的氫鍵斷裂，雙螺旋解旋和分開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來(lái)DNA分子的堿基排列順序完全一樣。在此過(guò)程中，每個(gè)子代分子的一條多核苷酸鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，又以氫鍵連接成新的雙螺旋結(jié)構(gòu) (圖5－7)。
DNA復(fù)制時(shí)，其雙連首先解開，形成復(fù)制叉。復(fù)制起點(diǎn)是固定的，表現(xiàn)為固定的序列，并識(shí)別參與復(fù)制起始的特殊蛋白質(zhì)，復(fù)制叉移動(dòng)的方向和速度雖是多種多樣的，但以雙向等速為主。無(wú)論是真核生物還是原核生物，它們的DNA
圖5－7. DNA的復(fù)制方式
復(fù)制都是半保留、半不連續(xù)復(fù)制，復(fù)制過(guò)程都存在引發(fā)、延長(zhǎng)和終止3個(gè)階段，都必須有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)（如SSB）和酶（如DNA聚合酶）參與。但真核生物每條染色體上都可以有多處復(fù)制起始點(diǎn)，而原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)；真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上的DNA的復(fù)制不能再開始，而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)上可以連續(xù)開始新的DNA的復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個(gè)復(fù)制單元，但可有多個(gè)復(fù)制叉。
1.2.3. RNA
RNA(ribonucleic acid) 又稱核糖核酸，有四種類型：tRNA、rRNA、mRNA和反義RNA。它們均由DNA轉(zhuǎn)錄而成，和DNA很相似，不同的是以核糖代替脫氧核糖，以尿嘧啶(uracil，簡(jiǎn)稱U)代替胸腺嘧啶(T)。因此，RNA鏈中的堿基配對(duì)為：A—U、U—A、G—C、C—G等四種。tRNA叫轉(zhuǎn)移RNA，是模板與氨基酸之間的接合體，其上有和mRNA互補(bǔ)的反密碼子，能識(shí)別氨基酸及識(shí)別mRNA上的密碼子，在tRNA—氨基酸合成酶的作用下具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。其在蛋白質(zhì)生物合成的起始作用中，在DNA反轉(zhuǎn)錄合成中及其他代謝調(diào)節(jié)中都起重要作用。細(xì)胞內(nèi)t RNA的種類很多，每一種氨基酸都有其相應(yīng)的一種或幾種t RNA。rRNA即核糖體RNA ，它和蛋白質(zhì)結(jié)合成的核糖體為合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。rRNA 含量大，是構(gòu)成核糖體的骨架。大腸桿菌核糖體有三類rRNA ：5SrRNA,16S rRNA ,23RNA。 mRNA叫信使RNA，mRNA 上每三個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸就稱為密碼，也叫三聯(lián)子密碼。mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過(guò)遺傳密碼的破譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的，貯存在DNA上的遺傳信息通過(guò)mRNA傳遞給蛋白質(zhì)。每一種多肽都有一種特定的 mRNA 負(fù)責(zé)編碼，所以細(xì)胞內(nèi)mRNA 的種類是很多的，但是每一種mRNA的含量又十分低。反義RNA是能與DNA的堿基互補(bǔ)，并能阻止、干擾復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯的短小 的RNA。反義RNA起調(diào)節(jié)作用，決定mRNA翻譯合成速度。由mRNA、tRNA、反義RNA和rRNA協(xié)作合成蛋白質(zhì)。
1.3. 遺傳物質(zhì)的存在形式
真核生物(人、高等動(dòng)物、植物、真菌、藻類及原生動(dòng)物)的遺傳物質(zhì)是DNA，其染色體由DNA和蛋白質(zhì)等組成。真核生物的染色體不止一個(gè)，少的幾個(gè)，多的幾十或更多，染色體呈絲狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有染色體由核膜包裹成一個(gè)細(xì)胞核。真核微生物染色體以外的DNA主要以細(xì)胞器形式存在，這些細(xì)胞器中的DNA常呈環(huán)狀，細(xì)胞器DNA的含量只占染色體DNA的1%以下。
原核微生物的染色體往往只有一個(gè)，是由單純的DNA或 RNA組成。細(xì)菌和放線菌的遺傳物質(zhì)單純由一條DNA細(xì)絲構(gòu)成環(huán)狀的染色體，拉直時(shí)比細(xì)胞長(zhǎng)許多倍，為雙鏈的DNA，與很少量的蛋白質(zhì)結(jié)合，沒(méi)有核膜包圍，它在細(xì)胞的中央，高度折疊形成具有空間結(jié)構(gòu)的一個(gè)核區(qū)。由于含有磷酸根，它帶有很高的負(fù)電荷。原核微生物DNA的負(fù)電荷被Mg2+離子和有機(jī)堿：精胺、亞精胺和腐胺等中和。真核生物DNA的負(fù)電荷被堿性蛋白質(zhì)：組蛋白和魚精蛋白中和。病毒中的遺傳物質(zhì)是DNA或 RNA，為雙鏈或單鏈，呈線狀或環(huán)狀，且病毒的核酸都不與蛋白質(zhì)相結(jié)合。原核微生物染色體外的DNA稱為細(xì)菌質(zhì)粒，例如原核生物中的性因子(F因子)，抗藥性因子(R因子)等，它們的DNA只占染色體DNA的一小部分。
20世紀(jì)50年代以前，許多學(xué)者認(rèn)為蛋白質(zhì)對(duì)于遺傳變異起著決定性的作用，而通過(guò)對(duì)高等動(dòng)物和植物染色體的化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)染色體由核酸和蛋白質(zhì)，并且主要是脫氧核糖核酸（DNA）組成。因此，要回答究竟是蛋白質(zhì)還是核酸對(duì)于遺傳變異起著決定性的作用，經(jīng)研究，人們認(rèn)識(shí)到以微生物為研究材料具有特殊的優(yōu)越性，于是通過(guò)以下三個(gè)經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)，充分證明了遺傳變異的物質(zhì)基礎(chǔ)是核酸。
1.1.1. 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)
轉(zhuǎn)化是指受體細(xì)胞直接攝取供體細(xì)胞的遺傳物質(zhì)（DNA片段），將其同源部分進(jìn)行堿基配對(duì)，組合到自己的基因中，從而獲得供體細(xì)胞的某些遺傳性狀，這種變異現(xiàn)象，稱為轉(zhuǎn)化。
肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象最早是由英國(guó)的細(xì)菌學(xué)家格里菲斯(Griffith)于1928年發(fā)現(xiàn)的。肺炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)是一種病原菌，存在著光滑型(Smooth簡(jiǎn)稱S型)和粗糙型(Rough簡(jiǎn)稱R型) 兩種不同類型。其中光滑型的菌株產(chǎn)生莢膜，有毒，在人體內(nèi)它導(dǎo)致肺炎，在小鼠體中它導(dǎo)致敗血癥，并使小鼠患病死亡，其菌落是光滑的；粗糙型的菌株不產(chǎn)生莢膜，無(wú)毒，在人或動(dòng)物體內(nèi)不會(huì)導(dǎo)致病害，其菌落是粗糙的。格里菲斯以R型和S型菌株作為實(shí)驗(yàn)材料進(jìn)行遺傳物質(zhì)的實(shí)驗(yàn)，他將活的、無(wú)毒的RⅡ型（無(wú)莢膜，菌落粗糙型）肺炎雙球菌或加熱殺死的有毒的SⅢ型肺炎雙球菌注入小白鼠體內(nèi)，結(jié)果小白鼠安然無(wú)恙；將活的、有毒的SⅢ型（有莢膜，菌落光滑型）肺炎雙球菌或?qū)⒋罅拷?jīng)加熱殺死的有毒的SⅢ型肺炎雙球菌和少量無(wú)毒、活的RⅡ型肺炎雙球菌混合后分別注射到小白鼠體 內(nèi)，結(jié)果小白鼠患病死亡，并從小白鼠體內(nèi)分離出活的SⅢ型菌。格里菲斯稱這一現(xiàn)象為轉(zhuǎn)化作用(圖5－1)，實(shí)驗(yàn)表明，SⅢ型死菌體內(nèi)有一種物質(zhì)能引起RⅡ型活菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生SⅢ型菌，這種轉(zhuǎn)化的物質(zhì)（轉(zhuǎn)化因子）是什么?格里菲斯對(duì)此并未做出回答。1944年美國(guó)的埃弗雷(O．Avery)、麥克利奧特(C. Macleod)及麥克卡蒂(M．Mccarty)等人在格里菲斯工作的基礎(chǔ)上，對(duì)轉(zhuǎn)化的本質(zhì)進(jìn)行了深入的研究。他們從SⅢ型活菌體內(nèi)提取DNA、RNA、蛋白質(zhì)和莢膜多糖，將它們分別和 RⅡ型活菌混合均勻后注射人小白鼠體內(nèi)，結(jié)果只有注射SⅢ型菌DNA和RⅡ型活菌的混合液的小白鼠才死亡，這是一部分 RⅡ型菌轉(zhuǎn)化產(chǎn)生有毒的、有莢膜的SⅢ型菌所致，并且它們的后代都是有毒、有莢膜的。由此說(shuō)明RNA、蛋白質(zhì)和莢膜多糖均不引起轉(zhuǎn)化，而DNA卻能引起轉(zhuǎn)化。如果用DNA酶處理DNA后，則轉(zhuǎn)化作用喪失。
圖5－1. 肺炎雙球菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象
1.1.2. 噬菌體的感染實(shí)驗(yàn)
證明DNA是遺傳物質(zhì)，還可用T2噬菌體感染大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)來(lái)證實(shí)。1952年赫西(A．Hershey)和蔡斯(M．Chase)用32P043-和35S042-標(biāo)記T2噬菌體，因DNA分子中只含磷不含硫，而蛋白質(zhì)分子中只含硫不含磷。故將T2噬菌體的頭部DNA標(biāo)上32P，其蛋白質(zhì)衣殼被標(biāo)上35S。用標(biāo)上32P和35S的T2噬菌體感染大腸桿菌，經(jīng)短時(shí)間的保溫后，T2噬菌體完成了吸附和侵入的過(guò)程。將被感染的大腸桿菌洗凈放入組織搗碎器內(nèi)強(qiáng)烈攪拌，然后離心沉淀。分別測(cè)定沉淀物和上清液中的同位素標(biāo)記，結(jié)果全部35S和噬菌體在上清液中，全部32P和細(xì)菌聚集在沉淀物中。這說(shuō)明在感染過(guò)程中 噬菌體的DNA進(jìn)人大腸桿菌細(xì)胞中，它的蛋白質(zhì)外殼留在菌體外。進(jìn)入大腸桿菌體內(nèi)的T2噬菌體DNA，利用大腸桿菌體內(nèi)的DNA、酶及核糖體復(fù)制大量T2噬菌體，又一次證明了DNA是遺傳物質(zhì)(圖5－2)。
1.1.3. 煙草花葉病毒的拆開與重建實(shí)驗(yàn)
煙草花葉病毒(TMV)由蛋白質(zhì)外殼和核糖核酸 （RNA）核心所構(gòu)成，可以從TMV病毒分別抽提得到它的蛋白質(zhì)部分和RNA部分，把這兩個(gè)部分放在一起，可以得到具有感染能力的煙草花葉病毒顆粒。1965年，美國(guó)的法朗克一康勒特(Fraenkel Conrat)將煙草花葉病毒拆成蛋白質(zhì)和RNA(該病毒不含DNA)，分別對(duì)煙草進(jìn)行感染實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)只有RNA能感染煙草，并在感染后的寄主中分離到完整的具有蛋白質(zhì)外殼和RNA核心的煙草花葉病毒。煙草花葉病毒有不同的變種，各個(gè)變種的蛋白質(zhì)的氨基酸組成有細(xì)微而明顯的區(qū)別，后來(lái)法朗克一康勒特又將甲、乙兩種變種的煙草花葉病毒拆開，在體外分別將甲病毒的蛋白質(zhì)和乙病毒的RNA結(jié)合，將甲病毒的RNA和乙病毒的蛋白質(zhì)結(jié)合進(jìn)行重建，并用這些經(jīng)過(guò)重建的雜種病毒分別感染煙草，結(jié)果從寄主分離所得的病毒蛋白質(zhì)均取決于相應(yīng)病毒的RNA(圖5－3)。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明病毒蛋白質(zhì)的特性由它的核酸(RNA)所決定，而不是由蛋白質(zhì)所決定�？梢娫谶@里同樣證明了核酸(RNA)仍然是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)。
圖5－2. T2噬菌體感染試驗(yàn)示意圖
到目前為止，發(fā)現(xiàn)只有一部分病毒（包括動(dòng)物、植物病毒和噬菌體）的遺傳物質(zhì)是RNA，其他生物的遺傳物質(zhì)都是DNA。
圖5－3. 病毒重組實(shí)驗(yàn)示意圖
1.2. DNA的結(jié)構(gòu)與復(fù)制
1.2.1. DNA的結(jié)構(gòu)
現(xiàn)在我們已經(jīng)知道，DNA是遺傳物質(zhì)的基礎(chǔ)，那么，DNA為什么能起遺傳作用，它又是怎么起作用的呢？這與它的分子結(jié)構(gòu)是密切相關(guān)的。
DNA又稱脫氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid),是一種高分子化合物，其基本單位是脫氧核苷酸,相對(duì)分子質(zhì)量最小的為2.3×104，最大的達(dá)1×1010，比蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量(5×103~5×106)大。沃森(Watson)和克里克(Crick) 于1953年由X射線衍射結(jié)構(gòu)分析提出了DNA分子雙螺旋結(jié)構(gòu)理論和模型，認(rèn)為DNA是由兩條反向平行的多核苷酸鏈圍繞同一中心軸構(gòu)成的右手螺旋結(jié)構(gòu). (圖5—5)。多核苷酸的方向由核苷酸間的磷酸二酯鍵的走向決定,一條從5’到3’，另一條從3’到 5’。鏈間有螺旋型的凹槽，其中一條較淺，叫小溝；另一條較深，叫大溝。每條多核苷酸鏈上均有四種堿基：A(腺嘌呤adenine)、T(胸腺嘧啶thymine)、C (胞嘧啶cytosine)、G(鳥嘌呤guanine)有序地排列，它們以氫鍵與另一條多核苷酸鏈的四種堿基相連,A與T配對(duì),C與G配對(duì)，這種由氫鍵連接的堿基組合，稱堿基配對(duì)(圖5－4)。一個(gè)DNA分子可含幾十萬(wàn)或幾百萬(wàn)堿基對(duì)，相鄰堿基對(duì)平面之間的距離為0.34nm，即順中心軸方向,每隔0.34nm有一個(gè)核苷酸,以3.4nm為一個(gè)結(jié)構(gòu)重復(fù)周期，包括10對(duì)堿基。核苷酸的磷酸基與脫氧核糖在外側(cè)，通過(guò)磷酸二酯鍵相連接而構(gòu)成DNA分子的骨架。脫氧核酸環(huán)平面與縱軸大致平行，雙螺旋的直徑為2.0nm。
圖5－4. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中堿基配對(duì)示意圖
此模型所描述的資料來(lái)自在相對(duì)濕度為92％時(shí)所得到的DNA鈉鹽纖維，這種DNA稱為B型DNA（B-DNA），B-DNA雙螺旋的二級(jí)結(jié)構(gòu)既規(guī)則又很穩(wěn)定，但不是絕對(duì)的，它在環(huán)境中不停地運(yùn)動(dòng)，如室溫下DNA溶液中有部分氫鍵會(huì)斷開，造成這些部位結(jié)構(gòu)多變。水溶液及細(xì)胞中天然狀態(tài)DNA大多為B-DNA，但若濕度改變或由DNA鈉鹽變?yōu)殁淃}、銫鹽等則會(huì)引起構(gòu)象的變化，形成A-DNA、C-DNA等構(gòu)象。此外還有Z-DNA, Z-DNA結(jié)構(gòu)是1979年由Rich提出的(圖5－5)，該模型的提出曾一度動(dòng)搖過(guò)右手螺旋學(xué)說(shuō)�，F(xiàn)已證明，左手螺旋Z-DNA只是右手螺旋結(jié)構(gòu)模型的一個(gè)補(bǔ)充和發(fā)展。B-DNA是活性最高的DNA構(gòu)象，B-DNA變構(gòu)成A-DNA后，仍有活性，但若局部變構(gòu)為Z-DNA后活性明顯降低。
圖5－5. 兩種不同形式的DNA
DNA除了具有右旋、左旋的雙股螺旋結(jié)構(gòu)外，后來(lái)科學(xué)家在實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并合成了三股螺旋的DNA（圖5－6），它由15－25個(gè)核苷酸組成的短鏈反義核酸綁到雙股DNA中形成。1992年我國(guó)科學(xué)家首先發(fā)現(xiàn)具有三股螺旋的天然DNA�，F(xiàn)三股螺旋的DNA的存在已被國(guó)際公認(rèn)。
圖5－6. 三股螺旋結(jié)構(gòu)的DNA
一般而言，特定的種或菌株的DNA分子，其堿基順序固定不變，這保證了遺傳的穩(wěn)定性。如果DNA的個(gè)別部位發(fā)生了堿基排列順序的變化，則會(huì)導(dǎo)致菌株死亡或發(fā)生遺傳性狀的改變。在現(xiàn)代細(xì)菌分類鑒定中，通過(guò)測(cè)定G十C百分含量確定屬、種或菌株。
基因是一切生物體內(nèi)儲(chǔ)存遺傳信息的、有自我復(fù)制能力的遺傳功能單位。它是DNA分子上一個(gè)具有特定堿基順序，即核苷酸順序的片斷。按功能可分三種：第一種是結(jié)構(gòu)基因，編碼蛋白質(zhì)或酶的結(jié)構(gòu)，控制某種蛋白質(zhì)或酶的合成。但tRNA和rRNA基因不編碼蛋白質(zhì)。第二種是操縱區(qū)，它的功能像“開關(guān)”，操縱三個(gè)結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)。第三種是調(diào)節(jié)基因，它控制結(jié)構(gòu)基因。例如：大腸桿菌三種有關(guān)利用乳糖的酶是由三個(gè)結(jié)構(gòu)基因決定的。先由調(diào)節(jié)基因決定一種阻抑蛋白封閉操縱區(qū)的作用，使三個(gè)結(jié)構(gòu)基因都不能表達(dá)，阻抑了酶的合成。當(dāng)培養(yǎng)基中有乳糖時(shí)阻抑蛋白失活，不能封閉操縱區(qū)，因而結(jié)構(gòu)基因得以表達(dá)，合成能利用乳糖的酶。
一個(gè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量大約為6×l05，約有1000個(gè)堿基對(duì)，每個(gè)細(xì)菌約具有5000至10000個(gè)基因�；蚩刂七z傳性狀，但不等于遺傳性狀。任何一個(gè)遺傳性狀的表現(xiàn)都是在基因控制下的個(gè)體發(fā)育的結(jié)果。從基因型到表現(xiàn)型必須通過(guò)酶催化的代謝活動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)�；蛑苯涌刂泼傅暮铣桑纯刂埔粋�(gè)生化步驟，控制新陳代謝，從而決定了遺傳性狀的表現(xiàn)。
1.2.2. DNA的復(fù)制
菌株細(xì)胞在分裂之前，只有DNA十分精確地進(jìn)行復(fù)制，才能保證微生物的所有屬性都得到遺。而DNA的獨(dú)特的半保留式的自我復(fù)制能力，確保了DNA復(fù)制的精確性，并保證了一切生物遺傳性的相對(duì)穩(wěn)定。DNA的自我復(fù)制大致如下：首先是DNA分子中的兩條多核苷酸鏈之間的氫鍵斷裂，雙螺旋解旋和分開，每條鏈分別作為模板合成新鏈，產(chǎn)生互補(bǔ)的兩條鏈。這樣新形成的兩個(gè)DNA分子與原來(lái)DNA分子的堿基排列順序完全一樣。在此過(guò)程中，每個(gè)子代分子的一條多核苷酸鏈來(lái)自親代DNA，另一條鏈則是新合成的，又以氫鍵連接成新的雙螺旋結(jié)構(gòu) (圖5－7)。
DNA復(fù)制時(shí)，其雙連首先解開，形成復(fù)制叉。復(fù)制起點(diǎn)是固定的，表現(xiàn)為固定的序列，并識(shí)別參與復(fù)制起始的特殊蛋白質(zhì)，復(fù)制叉移動(dòng)的方向和速度雖是多種多樣的，但以雙向等速為主。無(wú)論是真核生物還是原核生物，它們的DNA
圖5－7. DNA的復(fù)制方式
復(fù)制都是半保留、半不連續(xù)復(fù)制，復(fù)制過(guò)程都存在引發(fā)、延長(zhǎng)和終止3個(gè)階段，都必須有相應(yīng)功能的蛋白質(zhì)（如SSB）和酶（如DNA聚合酶）參與。但真核生物每條染色體上都可以有多處復(fù)制起始點(diǎn)，而原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)；真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上的DNA的復(fù)制不能再開始，而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)上可以連續(xù)開始新的DNA的復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個(gè)復(fù)制單元，但可有多個(gè)復(fù)制叉。
1.2.3. RNA
RNA(ribonucleic acid) 又稱核糖核酸，有四種類型：tRNA、rRNA、mRNA和反義RNA。它們均由DNA轉(zhuǎn)錄而成，和DNA很相似，不同的是以核糖代替脫氧核糖，以尿嘧啶(uracil，簡(jiǎn)稱U)代替胸腺嘧啶(T)。因此，RNA鏈中的堿基配對(duì)為：A—U、U—A、G—C、C—G等四種。tRNA叫轉(zhuǎn)移RNA，是模板與氨基酸之間的接合體，其上有和mRNA互補(bǔ)的反密碼子，能識(shí)別氨基酸及識(shí)別mRNA上的密碼子，在tRNA—氨基酸合成酶的作用下具有轉(zhuǎn)運(yùn)氨基酸的作用。其在蛋白質(zhì)生物合成的起始作用中，在DNA反轉(zhuǎn)錄合成中及其他代謝調(diào)節(jié)中都起重要作用。細(xì)胞內(nèi)t RNA的種類很多，每一種氨基酸都有其相應(yīng)的一種或幾種t RNA。rRNA即核糖體RNA ，它和蛋白質(zhì)結(jié)合成的核糖體為合成蛋白質(zhì)的場(chǎng)所。rRNA 含量大，是構(gòu)成核糖體的骨架。大腸桿菌核糖體有三類rRNA ：5SrRNA,16S rRNA ,23RNA。 mRNA叫信使RNA，mRNA 上每三個(gè)核苷酸翻譯成蛋白質(zhì)多肽鏈上的一個(gè)氨基酸，這三個(gè)核苷酸就稱為密碼，也叫三聯(lián)子密碼。mRNA與蛋白質(zhì)之間的聯(lián)系是通過(guò)遺傳密碼的破譯來(lái)實(shí)現(xiàn)的，貯存在DNA上的遺傳信息通過(guò)mRNA傳遞給蛋白質(zhì)。每一種多肽都有一種特定的 mRNA 負(fù)責(zé)編碼，所以細(xì)胞內(nèi)mRNA 的種類是很多的，但是每一種mRNA的含量又十分低。反義RNA是能與DNA的堿基互補(bǔ)，并能阻止、干擾復(fù)制轉(zhuǎn)錄和翻譯的短小 的RNA。反義RNA起調(diào)節(jié)作用，決定mRNA翻譯合成速度。由mRNA、tRNA、反義RNA和rRNA協(xié)作合成蛋白質(zhì)。
1.3. 遺傳物質(zhì)的存在形式
真核生物(人、高等動(dòng)物、植物、真菌、藻類及原生動(dòng)物)的遺傳物質(zhì)是DNA，其染色體由DNA和蛋白質(zhì)等組成。真核生物的染色體不止一個(gè)，少的幾個(gè)，多的幾十或更多，染色體呈絲狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)所有染色體由核膜包裹成一個(gè)細(xì)胞核。真核微生物染色體以外的DNA主要以細(xì)胞器形式存在，這些細(xì)胞器中的DNA常呈環(huán)狀，細(xì)胞器DNA的含量只占染色體DNA的1%以下。
原核微生物的染色體往往只有一個(gè)，是由單純的DNA或 RNA組成。細(xì)菌和放線菌的遺傳物質(zhì)單純由一條DNA細(xì)絲構(gòu)成環(huán)狀的染色體，拉直時(shí)比細(xì)胞長(zhǎng)許多倍，為雙鏈的DNA，與很少量的蛋白質(zhì)結(jié)合，沒(méi)有核膜包圍，它在細(xì)胞的中央，高度折疊形成具有空間結(jié)構(gòu)的一個(gè)核區(qū)。由于含有磷酸根，它帶有很高的負(fù)電荷。原核微生物DNA的負(fù)電荷被Mg2+離子和有機(jī)堿：精胺、亞精胺和腐胺等中和。真核生物DNA的負(fù)電荷被堿性蛋白質(zhì)：組蛋白和魚精蛋白中和。病毒中的遺傳物質(zhì)是DNA或 RNA，為雙鏈或單鏈，呈線狀或環(huán)狀，且病毒的核酸都不與蛋白質(zhì)相結(jié)合。原核微生物染色體外的DNA稱為細(xì)菌質(zhì)粒，例如原核生物中的性因子(F因子)，抗藥性因子(R因子)等，它們的DNA只占染色體DNA的一小部分。