雞貧血病毒（CAV）是免疫抑制性疾病～雞傳染性貧血�。–IA）的主要病原，其不但引起骨髓等造血組織萎縮，導(dǎo)致嚴(yán)重貧血甚至死亡，而且引起胸腺等淋巴組織萎縮，導(dǎo)致免疫抑制。

    自日本1979年首次報(bào)道該病以來(lái)，世界主要養(yǎng)禽國(guó)家，如英國(guó)、丹麥、波蘭、美國(guó)、澳大利亞、荷蘭、巴西和阿根廷等國(guó)先后發(fā)現(xiàn)該病的存在。我國(guó)于1992年在黑龍江首次分離到該病毒，隨后在遼寧、吉林、山東、江蘇、河南等地的雞群中也陸續(xù)發(fā)現(xiàn)。該病在世界范圍內(nèi)廣泛分布，正在直接或間接地對(duì)世界養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。下面就對(duì)該病的診斷方法作一綜述。

    1 臨床癥狀

    采用1日齡SPF雛雞接種感染CAV后發(fā)生貧血癥狀，測(cè)定紅細(xì)胞壓積值，病雞血液的血細(xì)胞壓積值（HCT）明顯降低，各種血液細(xì)胞數(shù)量明顯減少，發(fā)病嚴(yán)重情況下HCT值可降到10%以下，血細(xì)胞數(shù)可降到1×10E6/ml以下。實(shí)驗(yàn)室內(nèi)常將HCT作為CIA的一個(gè)診斷指標(biāo)，一般將HCT低于27%判為發(fā)病。

    2 病原學(xué)診斷

    2.1 病毒的分離

    無(wú)菌操作采集可疑病例的肝臟，也可采集胸腺、骨髓、脾臟等組織。將采集的病料用滅菌PBS研磨，加入終濃度1000IU/ml的雙抗于37℃作用30min，反復(fù)凍融3～4次，離心;上清液加入50%體積氯仿作用15min，期間不停振搖，70℃處理5min，離心;上清液經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，置低溫冰箱凍存，待進(jìn)行病毒分離試驗(yàn)。體內(nèi)病毒分離實(shí)驗(yàn)的接種對(duì)象為1日齡SPF雛雞，體外病毒分離用MDCC～MSB細(xì)胞。過(guò)濾除菌后的病料上清接種MSBl細(xì)胞培養(yǎng)，可以用于雞貧血病毒的分離鑒定。接種病毒后，每隔2～3天傳代一次，連續(xù)傳4～7代，如果出現(xiàn)細(xì)胞腫脹，變大變圓，隨后有側(cè)解，細(xì)胞培養(yǎng)液不再變色，無(wú)法繼續(xù)傳代，可以初步確定為有CAV的存在。MSBl細(xì)胞也可以用于雞貧血病毒的毒價(jià)滴定，連續(xù)稀釋后的病毒接種MSBl細(xì)胞，在細(xì)胞板上連續(xù)傳4代以上，觀察細(xì)胞病變，也可以傳1代后，用熒光抗體來(lái)檢查雞貧血病毒的存在和病毒的滴度。

    2.2 病毒鑒定

    病毒的鑒定可以采用間接熒光法檢測(cè)抗原。取敏感動(dòng)物實(shí)驗(yàn)感染雞肝臟做組織冰凍切片，CAV感染陽(yáng)性組織切片在顯微鏡下可見(jiàn)熒光標(biāo)記。

     CAV感染陽(yáng)性細(xì)胞涂片在熒光顯微鏡下可見(jiàn)MDCC～MSBl細(xì)胞腫脹，細(xì)胞核內(nèi)顆粒狀或彌散狀熒光標(biāo)記，熒光標(biāo)記細(xì)胞的多少與毒株的感染力有關(guān)。陽(yáng)性對(duì)照可見(jiàn)到同樣結(jié)果，熒光標(biāo)記細(xì)胞在30%～60%左右，陰性對(duì)照細(xì)胞內(nèi)不出現(xiàn)熒光顆粒。

    3 血清學(xué)診斷

    CAV感染1日齡雛雞后產(chǎn)生的中和抗體能維持20周，感染10周齡以上的成雞后所產(chǎn)生的中和抗體能維持10～63周（一般為44周以上）。但是目前的研究一致表明，CAV感染雞血清中的中和抗體滴度較低，最高值為1∶5120，最低值為1∶20，低水平的母源抗體能有效地抵抗CAV的感染。病毒中和試驗(yàn)（VN）、間接熒光抗體試驗(yàn)、免疫過(guò)氧化物酶試驗(yàn)（IFA）和ELISA試驗(yàn)可用于檢查血清和卵黃中的抗體。

    3.1VN試驗(yàn)

    以56℃滅活30min的血清與2×10E3CEDso（可使50%雛雞致病的有效劑量）或200TCID50的病毒等體積混勻，37℃1h或4℃過(guò)夜，然后肌肉接種1日齡雛雞，連續(xù)觀察14天，雞健存;或MSBl細(xì)胞連續(xù)傳代培養(yǎng)7代以上，細(xì)胞新陳代謝仍活躍，可判定抗體陽(yáng)性。若作大批血清樣本檢測(cè)，一般采用微量VN反應(yīng)法。有時(shí)較低稀釋度的血清對(duì)細(xì)胞會(huì)有毒性或易引起對(duì)病毒的非特異性抑制。VN法的檢測(cè)靈敏度要高于其他血清學(xué)方法。在CAV感染雞產(chǎn)生的中和抗體的維持時(shí)間要明顯長(zhǎng)于IFA抗體維持時(shí)間。此方法有二個(gè)局限性：（1）使用該方法需至少培養(yǎng)7代MSBl細(xì)胞才可獲得血清的終點(diǎn)滴度;（2）VN法不適用于一些在MSBl不同的亞系上生長(zhǎng)不良或不能復(fù)制的CAV毒株。

    3.2

    間接熒光抗體試驗(yàn)（1FA）MDCC～MSBl細(xì)胞培養(yǎng)收獲的病毒可作為細(xì)胞抗原檢測(cè)血清。該抗原可與CAV陽(yáng)性血清反應(yīng)，用熒光標(biāo)記的抗雞IgG顯示，熒光顯微鏡下觀察，在腫脹的細(xì)胞核區(qū)出現(xiàn)較小的、形態(tài)不規(guī)則的熒光染色顆�；蜉啳h(huán)狀結(jié)構(gòu)，可判為抗體陽(yáng)性。但應(yīng)設(shè)立嚴(yán)格的陽(yáng)性血清、陰性血清和非CAV感染細(xì)胞作對(duì)照，以排除非特異性熒光和可能掩蓋特異性反應(yīng)的背景染色。

    3.3ELISA試驗(yàn)

    以部分純化的細(xì)胞培養(yǎng)毒直接包被ELISA板或用單克隆抗體包板捕獲細(xì)胞培養(yǎng)物中的病毒，可用于檢測(cè)血清抗體，并且都已用于商品化試劑盒的生產(chǎn)，但由于病毒復(fù)制量較低，成本較大，難以大批量生產(chǎn)和推廣。Kling（1991）、Otaki（1991）和王笑梅（1998）用病毒感染細(xì)胞或裂解上清液作為包被抗原建立了ELISA檢測(cè)方法，但效果不如純化或半純化的病毒。Pallister（1994）以大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的重組VPl建立間接ELISA、Kato（1995）以大腸桿菌內(nèi)表達(dá)的LacZ～VP3重組物建立間接ELISA、1wata（1997）以昆蟲細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的VP2和/或VP3表達(dá)物包板建立ELISA，都可檢測(cè)雞血清中的CAV抗體，并且與其他檢測(cè)方法（如IFA、VN等）結(jié)果的吻合性較好。因此，由于各CAV毒株的基因序列的保守性，以CAV基因的體外表達(dá)產(chǎn)物純化物作ELISA檢測(cè)原，用于檢測(cè)雞血清抗體的ELISA，被證明是既特異又敏感的方法，為CAV血清學(xué)診斷開(kāi)辟了一條新的途徑。

    4生物技術(shù)方法診斷

    隨著分子生物學(xué)新方法的不斷出現(xiàn)，PCR技術(shù)、核酸探針技術(shù)以及第二代ELISA技術(shù)等已用于CAV特異性檢測(cè)。對(duì)CAV抗原的檢測(cè)可采用PCR方法，C.Some（1993）報(bào)道，利用PCR技術(shù)可以從CAV感染雞體組織內(nèi)或感染細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)其DNA。Noteborn等采用同位素標(biāo)記克隆化的CAV基因組作探針進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)，能夠檢測(cè)出不同毒株感染的細(xì)胞中雙鏈復(fù)制型及單鏈環(huán)狀CAV基因組。Todd等用P32標(biāo)記的克隆化CAVDNA片段作探針，可檢測(cè)到CAV感染雞組織中特異性DNA，隨后Noteborn等用非放射性的地高辛（Digoxigenin）標(biāo)記探針，成功地檢測(cè)了多株CAV分離株。1995年Nielsen等用生物素標(biāo)記的雙股DNA探針進(jìn)行原位雜交試驗(yàn)，不僅可以檢測(cè)到人工感染發(fā)病雞體內(nèi)的CAV，而且可以檢測(cè)患藍(lán)翅病病雞體內(nèi)所含的CAVDNA。

    為適應(yīng)檢測(cè)敏感性的需要，CAV特異性PCR技術(shù)在實(shí)驗(yàn)室診斷及疫苗試驗(yàn)上充分體現(xiàn)了該法不可比擬的優(yōu)勢(shì)，它不僅與病毒分離法一樣敏感，而且能檢測(cè)到高背景DNA下的CAV分子。Soine等利用套式PCR法（多組引物）擴(kuò)增出能和特異性探針發(fā)生雜交的CAV基因，但此法易造成假陽(yáng)性結(jié)果。CAV感染劑量大小將直接影響其致病程度，故檢出敏感細(xì)胞或組織中的病毒含量尤為重要。Dren等采用熱啟動(dòng)PCR法不僅克服了上述缺陷，而且還成功地檢測(cè)到一個(gè)感染細(xì)胞，相當(dāng)于10TCIDs0的CAV分子。