菌種是國家重要的生物資源，鑒于其自身的遺傳性和變異性，在菌種保藏過程中，如何降低菌種的衰亡速度，防止雜菌污染，保持菌種遺傳性狀不變異，使優(yōu)良高產(chǎn)菌株長期在生產(chǎn)中應用，成為食用菌領(lǐng)域一項重要的課題。為適應群眾性生產(chǎn)的需要，為適應群眾性生產(chǎn)的需要，本文介紹了幾種簡單易行、實用效果好的菌種保藏方法。

一、菌種保藏基本原理

    通過低溫、干燥、缺氧和饑餓等手段來達到最大限度降低菌絲體的生理代謝。首先要挑選優(yōu)良純菌種，包括菌絲體和它們的孢子；其次，根據(jù)其生理、生化特點，人為創(chuàng)造低溫、干燥或缺氧等條件，抑制微生物的代謝作用，使其生命活動降低到極低的程度或處于休眠狀態(tài)，從而延長菌種生命以及使菌種保持原有的性狀，防止變異。

二、 菌種保藏的方法

試管斜面菌種系列保存方法

    1、低溫定期移植保藏法

    將需要保藏的菌種接種在適宜的斜面培養(yǎng)基上，適溫培養(yǎng)，當菌絲健壯地長滿斜面時取出，放在3~5℃低溫干燥處或4℃冰箱中保藏，每隔3~6個月移植轉(zhuǎn)管1次，具體應根據(jù)菌種特性決定。保藏時要注意環(huán)境濕度不能太高，以防霉菌通過棉塞進入管內(nèi)。因此，若用棉塞，可用干凈的塑料薄膜或牛皮紙包扎棉塞，也可用無菌的白膠塞，并用石蠟涂封，即可減少污染的機會，也可防止培養(yǎng)基干燥。除草菇外，大多食用菌菌種都能采用此法保藏。

    2、液體石蠟保藏法

    取化學純液體石蠟裝于三角瓶中高壓滅菌后，放入40℃恒溫箱中，蒸發(fā)其中水分，至石蠟油完全透明為止。將處理好的石蠟油移接在空白斜面上，28～30℃下培養(yǎng)2～3d，證明無雜菌生長方可使用。然后將母種接在斜面培養(yǎng)基上，當菌絲在斜面上生長豐滿后，將液體石蠟注在斜面上，注入量以高出斜面1cm為宜，使菌種與空氣隔絕，降低其新陳代謝能力。管口用滅過菌的白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，直立放在室內(nèi)干燥處或冰箱內(nèi)保藏。一般可保存1年以上，在低溫下保藏時間還可延長。使用時從斜面上挑取菌絲少許，移接到新鮮斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)即可。由于菌絲體沾有液體石蠟而影響其生長，需再經(jīng)1次移接才能恢復正常生長。

    3、白膠塞封口保存法

    選擇與試管口徑相符的白膠塞，用0.2%煤酚皂溶液洗滌，浸泡在酒精內(nèi)待用。當試管斜面長滿菌絲后，在無菌條件下拔去棉塞，取浸泡的白膠塞1個，通過火焰迅速塞入試管口內(nèi)，并用石蠟熔封。此法能達到與石蠟油封存相似的效果。用該法保存菌種可存活1～3年，但以每年移植1次為好。

   4、蒸餾水保藏法

    將8成熟試管菌種放在接種箱內(nèi)，注入蒸餾水，將培養(yǎng)基斜面全部淹沒至管口2cm。管口用白膠塞塞緊，并用石蠟涂封，常溫下置于陰涼處立放，可以保藏1年左右。

非斜面固體菌種系列保存法

    1、麥麩保藏法

    將麥麩和水按0.80∶1充分拌勻后，裝入試管高壓滅菌，經(jīng)無菌檢查合格后接種，適溫下培養(yǎng)至菌絲體發(fā)育好后，將試管放入真空干燥器內(nèi)，用真空泵將麥麩培養(yǎng)基內(nèi)水分抽干，然后移入盛有硅膠的干燥器內(nèi)，用凡士林密封在常溫下保存，可保藏3～5年。

    2、麥粒保藏法

    取優(yōu)質(zhì)小麥，淘洗后浸入20℃水中5h，撈出稍晾干，裝入試管，占管深1/3，高壓滅菌后趁熱搖散，冷卻后接入菌絲體，適溫培養(yǎng)至菌絲長滿基質(zhì)后用石蠟封棉塞，置于冰箱或20℃以下干燥處，可保藏1～2年。

    3、木屑保藏法

    將闊葉樹木屑78％、麥麩20％、蔗糖1％、石膏粉1％，混合后加水拌勻，裝入試管滅菌后，接入斜面菌種，在適溫下培養(yǎng)，待菌絲長至試管2/3時用石蠟封棉塞，置低溫或常溫下保藏，一般可保藏1~ 2年。

    4、稻草粉保存草菇菌種

    草菇斜面菌種在2～4℃下保存2d便失去生活力，室溫下保存又因斜面培養(yǎng)基失水太快影響菌種存活。用稻草粉保存草菇菌種有其獨特的優(yōu)越性。其配方為稻草粉75%、麥麩22%、石膏粉1%、碳酸鈣1%、蔗糖1%、適量的水拌勻調(diào)濕。裝入試管高壓滅菌后按常規(guī)接種培養(yǎng)，當菌絲長到試管2/3時，管口棉塞用石蠟熔封。常溫下保存至次年，不影響其活力和種性。

液體系列菌種保存法

    1、生理鹽水保藏法

    將待保藏的菌種接入馬鈴薯培養(yǎng)液中，在250mL三角形瓶中裝60mL培養(yǎng)液，振蕩培養(yǎng)或每天搖動5～10次，培養(yǎng)5～7d，然后將形成的菌絲球用無菌吸管吸入裝有５mL無菌生理鹽水試管中，每管移入4～5個菌絲球，塞上無菌白膠塞，用石蠟涂封，置低溫下可保藏1～2年。

    2、營養(yǎng)液保存法

    營養(yǎng)液的配方為馬鈴薯汁20%、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.15%、硫酸銨微量。每支試管內(nèi)裝5mL，滅菌后用無菌吸管吸取生理鹽水保藏法深層培養(yǎng)的菌絲球4～5個于試管中，10~25℃的室溫下保存，可存活2～3年，其保存效果優(yōu)于生理鹽水保存法。不影響菌株形成子實體的能力。

    3、無菌水保存法

    先將培養(yǎng)好的斜面菌種切成小塊，連同培養(yǎng)基移入盛有適量無菌蒸餾水的試管中，然后用白膠塞封口，在20℃左右的室溫下保存。可存活1～2年。也可用磷酸緩沖液做保存液，其緩沖液的pH值視各保存菌株生長的酸堿度而定。該法操作簡便易行。

利用孢子保存菌種系列方法

    1、濾紙片保藏法

    取白色（收集深色孢子）或黑色（收集白色孢子）濾紙，剪成4.0cm×0.8cm的小紙條，平鋪在培養(yǎng)皿中用紙包裹進行滅菌。采用鉤懸法收集孢子，讓孢子落在濾紙條上。將載有孢子的濾紙條放入保藏試管中，白膠塞封口，再將保藏試管放入干燥器中1～2d，除去濾紙水分，然后低溫保藏。保存期可達２～10年。

    2、沙土管保藏法

    取河沙用水浸泡洗滌數(shù)次，過60目篩除去粗粒，加用1％稀鹽酸煮沸30min，以除去其中的有機質(zhì)，再用水沖洗至pH值達到中性，烘干備用。同時取非耕作層的瘦黃土或紅土，用水反復沖洗至中性，烘干碾細，過100目篩，將處理好的沙與土以2～4∶1混勻，然后分裝小試管內(nèi)，每管裝0.5g，高壓滅菌（1.5kg/cm2）3次，再干熱滅菌（160℃，2h）1次，待無菌檢驗合格后方可使用。將已形成孢子的斜面菌種，在無菌條件下注入無菌水3mL，刮菌苔，制成菌懸液，再用無菌吸管吸取菌液滴入砂土管中，以浸透砂土為止。將接種后的沙土管放入盛有干燥劑的真空干燥器內(nèi)，接上真空泵抽氣至沙土干燥為止。真空干燥操作需在孢子接入后48h內(nèi)完成，以免孢子發(fā)芽。制備好的沙土管石蠟封口，在低溫下可保藏2～10年。

    此外，還有甘油保藏法、枝條保藏法、超低溫液氮保藏法、冷凍真空干燥法等。菌種保藏方法雖多，但也各有利弊。其中低溫定期移植保藏法雖然簡單易行，不需特殊設備，但需幾個月轉(zhuǎn)管1次，轉(zhuǎn)管的次數(shù)多了，變異的可能性就增大，易造成菌種衰退。

    近年來人們找到一種目前認為最有效廣譜安全的保藏方法——超低溫液氮保藏法，ATCC 用這種方法保藏雙孢蘑菇，9年后菌種仍保持穩(wěn)定，是目前國際上公認為較為理想的菌種保藏方法。但需要液氮保藏罐設備，且液氮來源有限，費用高，只有少數(shù)科研院所使用，無法推廣。此外，還有冷凍真空干燥法，此法一般可保存10年以上，但成本較高。

三、菌種保藏效果的鑒定

    常用指標是菌株的存活率和接種物成活率。為確切判斷菌株在保藏后是否發(fā)生變異，還須從以下4個方面進行觀察和測定：①生物學特征，如菌絲形態(tài)、顏色等；②對基質(zhì)分解能力，如走菌、吃料速度等；③遺傳特征，如相關(guān)酶的酶譜、酶活力等；④生產(chǎn)出菇能力，包括產(chǎn)量、質(zhì)量。通過經(jīng)常檢驗，以確保不出現(xiàn)任何退化跡象的菌株取得菇農(nóng)的信賴。通過保藏菌種的效果鑒定，可以對保藏方法加以改善，使保藏體系更加完善。