葛根為豆科植物野葛Pueraria lobata(Willd.)Ohwi的干燥根。2005版《中國(guó)藥典》一部采用高效液相色譜法測(cè)定其葛根素的含量。
一、高效液相色譜法
2005版《中國(guó)藥典》葛根含量測(cè)定項(xiàng)下:
色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn):以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑;以甲醇-水(25:75)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm。理論板數(shù)按葛根素峰計(jì)算應(yīng)不得低于4000。
供試品溶液的制備:取本品粉末約0.1g,精密稱定,置錐形瓶中,精密加入30%乙醇50ml,稱定重量,加熱回流30分鐘,放冷,再稱定重量,用30%乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過(guò),取續(xù)濾液,即得。
HPLC法測(cè)定葛根及其制劑中葛根素的含量時(shí),使用最多的流動(dòng)相系統(tǒng)為甲醇-水系統(tǒng),另外還有甲醇-水,加醋酸調(diào)節(jié)pH等。
A:以甲醇-水為系統(tǒng)的,常見的比例及實(shí)驗(yàn)條件為:
①Waters2695/ 2996/ Empower 色譜系統(tǒng);色譜柱Symmetry C18 柱( 3.9mm×150mm, 5μm);流動(dòng)相:甲醇-水(25:75);DAD檢測(cè)波長(zhǎng)254nm;柱溫35℃。
②SP8800 型高效液相色譜泵;Hypersil ODS (4.6mm×250mm,5μm大連依利特科學(xué)有限公司);流動(dòng)相:甲醇-水(30:70);柱溫40℃;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
③Waters高效液相色譜儀;十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(4.6mm×250mm,5μm);甲醇-水(40:60)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm;柱溫30℃。
④美國(guó)Spectra-Physics 液相色譜儀;色譜柱Lunm C18 (150mm×4.6mm, 5μm ) 不銹鋼柱(美國(guó)Phenom enex 公司);流動(dòng)相為甲醇-水(28:72);檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;柱溫30℃。
B:乙腈-水系統(tǒng):
①LC-10ATvp高效液相色譜儀;Hypersil ODS 色譜柱(4.6mm×150mm,5μm);乙腈-水(15:85)為流動(dòng)相;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
②TSP 高效液相色譜儀;色譜柱Turner C18H37(5μm,4.6mm×150mm);流動(dòng)相:乙醇-水(43:207);柱溫30℃;檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
C:加酸調(diào)節(jié)的,如:
①LC-10A高效液相色譜儀;色譜柱為ODSC18柱(5μm,4.6mm×150mm);流動(dòng)相為甲醇-水(35:65),內(nèi)含0.01%醋酸;柱溫35℃;檢測(cè)波長(zhǎng)251nm。
②SP-8800高效液相色譜儀;色譜柱ODS-C18柱(4.6mm×250mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-1.4%醋酸溶液( 22:78 );柱溫室溫;測(cè)定波長(zhǎng): 250nm。
③美國(guó)Beckman公司高效液相色譜儀;Hypersil ODS柱(2.5μm,4.6mm×250mm);流動(dòng)相為甲醇-氯仿-1.5%冰醋酸(22:1:77);檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
④SP1000 高效液相色譜泵;色譜柱YMC C18不銹鋼柱(4.6mm×150mm,5μm);流動(dòng)相:甲醇-水醋酸(42∶100:0.2);檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;柱溫:室溫。
其它如:呂竹芬等測(cè)定心血寧滴丸中葛根素的含量,采用高效液相色譜法,Dikma piamonsil C18色譜柱(4.6mm×200mm,5μm),以甲醇-乙腈-水(30:2 :65)為流動(dòng)相,流速為1.0mL/min,檢測(cè)波長(zhǎng)250nm。
顏春華等測(cè)定腦得生片中葛根素的含量,采用日本島津LC-4A高效液相色譜儀;色譜柱DiamonsilTM (鉆石) C18(200mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相:乙腈-甲醇-0.1%枸櫞酸溶液(5:25:75);紫外檢測(cè)波長(zhǎng)250nm;柱溫室溫。
制備樣品溶液時(shí),一般以30%乙醇、50%乙醇、乙醇、甲醇、流動(dòng)相或鹽酸溶液(9→1000)等為溶劑,采用超聲法提取。
二、其它
楊振林等測(cè)定葛根沖劑中葛根素含量,采用薄層- 紫外分光光度法,751GD 型分光光度計(jì)(上海分析儀器總廠)。薄層層析硅膠G板,以氯仿-甲醇-水(7:28:0.2)為展開劑,在紫外燈(365nm)下定葛根素位置,刮下斑點(diǎn),用甲醇洗脫,測(cè)定波長(zhǎng)為251±1nm。
崔小兵等測(cè)定通脈顆粒劑中葛根素及阿魏酸的含量,采用雙波長(zhǎng)(λ1= 250nm ,λ2=313nm) 梯度洗脫法。Waters 2690 型高效液相色譜儀;色譜柱Kromasil C18柱(4.6mm×250mm,5μm);柱溫為30℃,甲醇-1%醋酸水梯度洗脫;檢測(cè)波長(zhǎng)為250nm;柱溫30℃。
方崇波等采用離子絡(luò)合紫外分光光度法測(cè)定葛根素及其制劑的含量,采用UV4/2401 紫外分光光度計(jì)(島津)。方法::在pH=4.0條件下,葛根素和Al3+形成絡(luò)合物,在339.8 nm波長(zhǎng)處通過(guò)測(cè)定吸收度的改變來(lái)測(cè)定含量。