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蛋白質(zhì)的定量分析是生物化學(xué)和其它生命學(xué)科最常涉及的分析內(nèi)容，是臨床上診斷疾病及檢查康復(fù)情況的重要指標(biāo)，也是許多生物制品，藥物、食品質(zhì)量檢測(cè)的重要指標(biāo)。在生化實(shí)驗(yàn)中，對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確可靠的定量分析，則是經(jīng)常進(jìn)行的一項(xiàng)非常重要的工作。
蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類(lèi)很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：
物理性質(zhì)：紫外分光光度法。
化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法。
染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法。
其他性質(zhì)：熒光法。
蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒�，以滿(mǎn)足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開(kāi)始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。
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常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較
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下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。
一、 Folin－酚試劑法（又名Lowry）法
一、實(shí)驗(yàn)原理
這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。
二、優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；
缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。
三、試劑與器材
1.試劑
（1）試劑甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500毫升蒸餾水中。（B）0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。
（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。
（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。
2.器材
（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)；
（2）旋渦混合器；
（3）秒表；
（4）試管16支。
四、操作方法
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。
2.樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。
五、注意事項(xiàng)
（1）對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。
（2含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
考馬斯亮藍(lán)法
一、實(shí)驗(yàn)原理
考馬斯亮藍(lán) (Coomassie Brilliant Blue) 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。
考馬斯亮藍(lán) G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
二、優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) 1 mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測(cè)定法。
缺點(diǎn)（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
三、試劑與器材
1、試劑
考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán) G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
3、器材
試管 1.5×15 cm（×6）；
試管架；
移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；
恒溫水浴；
分光光度計(jì)。
四、操作方法
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
取 7 支試管，按下表平行操作。
搖勻，1 h 內(nèi)以 0 號(hào)管為空白對(duì)照，在 595 nm 處比色。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 A595 nm 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的 A595 nm 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。
五、注意事項(xiàng)
（1）在試劑加入后的 5-20 min 內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。
（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。
（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。
一、實(shí)驗(yàn)原理
BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。
二、該方法的優(yōu)點(diǎn)
(一) 操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；
(二) 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。
(三) 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；
(四) 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響 。
三、實(shí)驗(yàn)材料
1.實(shí)驗(yàn)器材
721分光光度計(jì)；
恒溫水浴槽；
移液管；
微量進(jìn)樣器；
試管架和試管。
2.實(shí)驗(yàn)試劑
(1) BCA試劑的配制 ① 試劑A，1L：分別稱(chēng)取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。② 試劑B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。③ BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。
(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。
(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。
四、實(shí)驗(yàn)方法
方法一：96 孔板
1. 配制 BCA 工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到 10 μL。取 10 μL 待測(cè)樣品加入 96 孔板的待測(cè)樣品孔中。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。
3. 向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。
4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標(biāo)儀 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
6. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。
方法二：試管法
1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測(cè)定所用的比色杯對(duì)應(yīng)。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實(shí)驗(yàn)將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。
2. BSA 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測(cè)定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備 3 個(gè)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般 5~6 個(gè)點(diǎn)即可。根據(jù)樣品的估測(cè)濃度確定各點(diǎn)的具體濃度。稀釋 BSA 時(shí)可以用水或與樣品一致的溶液。如待測(cè)樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
紫外分光光度計(jì)法
一、實(shí)驗(yàn)原理
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
二、結(jié)果計(jì)算
（1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）精確計(jì)算
通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計(jì)算最終結(jié)果：
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數(shù)
文章來(lái)源：網(wǎng)絡(luò)
蛋白質(zhì)是一種十分重要的生物大分子：它的種類(lèi)很多，結(jié)構(gòu)不均一，分子量又相差很大，功能各異，這樣就給建立一個(gè)理想而又通用的蛋白質(zhì)定量分析的方法帶來(lái)了許多具體的困難。目前測(cè)定蛋白質(zhì)含量的方法有很多種，下面列出根據(jù)蛋白質(zhì)不同性質(zhì)建立的一些蛋白質(zhì)測(cè)定方法：
物理性質(zhì)：紫外分光光度法。
化學(xué)性質(zhì)：凱氏定氮法、雙縮脲法、Lowry法，BCA法，膠體金法。
染色性質(zhì)：考馬氏亮藍(lán)染色法、銀染法。
其他性質(zhì)：熒光法。
蛋白質(zhì)測(cè)定的方法很多，但每種方法都有其特點(diǎn)和局限性，因而需要在了解各種方法的基礎(chǔ)上根據(jù)不同情況選用恰當(dāng)?shù)姆椒�，以滿(mǎn)足不同的要求。例如凱氏定氮法結(jié)果最精確，但操作復(fù)雜，用于大批量樣品的測(cè)試則不太合格；雙縮脲法操作簡(jiǎn)單，線性關(guān)系好，但靈敏度差，樣品需要量大，測(cè)量范圍窄，因此在科研上的應(yīng)用受到限制；而酚試劑法彌補(bǔ)了它的缺點(diǎn)，因而在科研中被廣泛采用，但是它的干擾因素多；考馬氏亮蘭染色法因其靈敏而又簡(jiǎn)便開(kāi)始重新受到關(guān)注；BCA法又以其試劑穩(wěn)定，抗干擾能力較強(qiáng)，結(jié)果穩(wěn)定，靈敏度高而受到歡迎；膠體金法具有較高的靈敏度，可達(dá)到毫微克水平，用于微量蛋白的測(cè)定。
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常用的測(cè)定蛋白質(zhì)含量方法的比較
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下面介紹Folin—酚試劑法，考馬氏亮藍(lán)G—250染色法，紫外分光光度法、膠體金法等幾種最常用使用的方法。
一、 Folin－酚試劑法（又名Lowry）法
一、實(shí)驗(yàn)原理
這種蛋白質(zhì)測(cè)定法是最靈敏的方法之一。過(guò)去此法是應(yīng)用最廣泛的一種方法，由于其試劑乙的配制較為困難（現(xiàn)在已可以訂購(gòu)），近年來(lái)逐漸被考馬斯亮蘭法所取代。此法的顯色原理與雙縮脲方法是相同的，只是加入了第二種試劑，即Folin—酚試劑，以增加顯色量，從而提高了檢測(cè)蛋白質(zhì)的靈敏度。這兩種顯色反應(yīng)產(chǎn)生深蘭色的原因是：在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的肽鍵與銅結(jié)合生成復(fù)合物。Folin—酚試劑中的磷鉬酸鹽—磷鎢酸鹽被蛋白質(zhì)中的酪氨酸和苯丙氨酸殘基還原，產(chǎn)生深蘭色（鉬蘭和鎢蘭的混合物）。在一定的條件下，蘭色深度與蛋白的量成正比。在生物化學(xué)領(lǐng)域得到廣泛的應(yīng)用。
此法可檢測(cè)的最低蛋白質(zhì)量達(dá)5mg。通常測(cè)定范圍是20~250mg。
二、優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多；
缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，要精確控制操作時(shí)間，標(biāo)準(zhǔn)曲線也不是嚴(yán)格的直線形式，且專(zhuān)一性較差，干擾物質(zhì)較多。
三、試劑與器材
1.試劑
（1）試劑甲：（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸鉀鈉（KNaC4H4O6·4H2O），溶解于500毫升蒸餾水中。（B）0.5克硫酸銅（CuSO4·5H2O）溶解于100毫升蒸餾水中，每次使用前，將50份（A）與1份（B）混合，即為試劑甲。
（2）試劑乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克鎢酸鈉，25克鉬酸鈉及700毫升蒸餾水，再加50毫升85%磷酸，100毫升濃鹽酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小時(shí)，回流結(jié)束時(shí)，加入150克硫酸鋰，50毫升蒸餾水及數(shù)滴液體溴，開(kāi)口繼續(xù)沸騰15分鐘，以便驅(qū)除過(guò)量的溴。冷卻后溶液呈黃色（如仍呈綠色，須再重復(fù)滴加液體溴的步驟）。稀釋至1升，過(guò)濾，濾液置于棕色試劑瓶中保存。使用時(shí)用標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定，酚酞作指示劑，然后適當(dāng)稀釋?zhuān)s加水1倍，使最終的酸濃度為1N左右。
（3）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液:精確稱(chēng)取結(jié)晶牛血清清蛋白或球蛋白，溶于蒸餾水，濃度為250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混濁，可改用0.9 % NaCl溶液。
2.器材
（1）可見(jiàn)光分光光度計(jì)；
（2）旋渦混合器；
（3）秒表；
（4）試管16支。
四、操作方法
1.標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定：取16支大試管，1支作空白，3支留作未知樣品，其余試管分成兩組，分別加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液（濃度為250mg/ml）。用水補(bǔ)足到1.0毫升，然后每支試管加入5毫升試劑甲，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫（20～25℃）放置10分鐘。再逐管加入0.5毫升試劑乙（Folin—酚試劑），同樣立即混勻。這一步混合速度要快，否則會(huì)使顯色程度減弱。然后在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對(duì)照，于700nm處測(cè)定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)的量為橫座標(biāo)，吸光度值為縱座標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線。注意：因Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間，即第1支試管加入5毫升試劑甲后，開(kāi)始計(jì)時(shí)，1分鐘后，第2支試管加入5毫升試劑甲，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。全部試管加完試劑甲后若已超過(guò)10分鐘，則第1支試管可立即加入0.5毫升試劑乙，1分鐘后第2支試管加入0.5毫升試劑乙，2分鐘后加第3支試管，余此類(lèi)推。待最后一支試管加完試劑后，再放置30分鐘，然后開(kāi)始測(cè)定光吸收。每分鐘測(cè)一個(gè)樣品。進(jìn)行多試管操作時(shí)，為了防止出錯(cuò)，必須在實(shí)驗(yàn)記錄本上預(yù)先畫(huà)好下面的表格。表中是每個(gè)試管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的順序，逐管加入。最下面兩排是計(jì)算出的每管中蛋白質(zhì)的量（微克）和測(cè)得的吸光度值。
2.樣品的測(cè)定：取1毫升樣品溶液（其中約含蛋白質(zhì)20~250微克），按上述方法進(jìn)行操作，取1毫升蒸餾水代替樣品作為空白對(duì)照。通常樣品的測(cè)定也可與標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定放在一起，同時(shí)進(jìn)行。即在標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定的各試管后面，再增加3個(gè)試管。如上表中的8、9、10試管。根據(jù)所測(cè)樣品的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出相應(yīng)的蛋白質(zhì)量，從而計(jì)算出樣品溶液的蛋白質(zhì)濃度。注意，由于各種蛋白質(zhì)含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，顯色的深淺往往隨不同的蛋白質(zhì)而變化。因而本測(cè)定法通常只適用于測(cè)定蛋白質(zhì)的相對(duì)濃度（相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)）。
五、注意事項(xiàng)
（1）對(duì)雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾Lowry反應(yīng)。而且對(duì)后者的影響還要大得多。酚類(lèi)、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸、糖類(lèi)、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸鈉（1%），硝酸鈉（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對(duì)顯色無(wú)影響，但這些物質(zhì)濃度高時(shí)，必須作校正曲線。
（2含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液，即可顯色測(cè)定。若樣品酸度較高，顯色后會(huì)色淺，則必須提高碳酸鈉—?dú)溲趸c溶液的濃度1~2倍。進(jìn)行測(cè)定時(shí)，加Folin—酚試劑時(shí)要特別小心，因?yàn)樵撛噭﹥H在酸性pH條件下穩(wěn)定，但上述還原反應(yīng)只在pH=10的情況下發(fā)生，故當(dāng)Folin一酚試劑加到堿性的銅—蛋白質(zhì)溶液中時(shí)，必須立即混勻，以便在磷鉬酸—磷鎢酸試劑被破壞之前，還原反應(yīng)即能發(fā)生。此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測(cè)定。
考馬斯亮藍(lán)法
一、實(shí)驗(yàn)原理
考馬斯亮藍(lán) (Coomassie Brilliant Blue) 法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，是利用蛋白質(zhì)―染料結(jié)合的原理，定量測(cè)定微量蛋白濃度快速、靈敏的方法。這種蛋白質(zhì)測(cè)定法具有超過(guò)其他幾種方法的突出優(yōu)點(diǎn)，因而正在得到廣泛的應(yīng)用。目前，這一方法是也靈敏度最高的蛋白質(zhì)測(cè)定法之一。
考馬斯亮藍(lán) G-250 染料，在酸性溶液中與蛋白質(zhì)結(jié)合，使染料的最大吸收峰 (lmax) 的位置，由 465 nm 變?yōu)?595 nm，溶液的顏色也由棕黑色變?yōu)樗{(lán)色。通過(guò)測(cè)定 595 nm 處光吸收的增加量可知與其結(jié)合蛋白質(zhì)的量。研究發(fā)現(xiàn)，染料主要是與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸 (特別是精氨酸) 和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合。
二、優(yōu)缺點(diǎn)
優(yōu)點(diǎn)：（1）靈敏度高，據(jù)估計(jì)比 Lowry 法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測(cè)量可達(dá) 1 mg。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比 Lowry 法要大的多。（2）測(cè)定快速、簡(jiǎn)便，只需加一種試劑。完成一個(gè)樣品的測(cè)定，只需要 5 分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過(guò)程，大約只要 2 分鐘即可完成，其顏色可以在 1 小時(shí)內(nèi)保持穩(wěn)定，且在 5 分鐘至 20 分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像 Lowry 法那樣費(fèi)時(shí)和需要嚴(yán)格地控制時(shí)間。（3）干擾物質(zhì)少。如干擾 Lowry 法的 K+、Na+、Mg2+ 離子、Tris 緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA 等均不干擾此測(cè)定法。
缺點(diǎn)（1）由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考馬斯亮藍(lán)染色法用于不同蛋白質(zhì)測(cè)定時(shí)有較大的偏差，在制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)通常選用 g-球蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。（2）仍有一些物質(zhì)干擾此法的測(cè)定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、 Triton X-100、十二烷基硫酸鈉 (SDS) 等。
三、試劑與器材
1、試劑
考馬斯亮藍(lán)試劑：考馬斯亮藍(lán) G-250 100 mg 溶于 50 mL 95% 乙醇中，加入 100 mL 85% 磷酸，用蒸餾水稀釋至 1000 mL。
2、標(biāo)準(zhǔn)和待測(cè)蛋白質(zhì)溶液
（1）標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度用 0.15 mol/L NaCl 配制成 1 mg/mL 蛋白溶液。
（2）待測(cè)蛋白質(zhì)溶液，人血清，使用前用 0.15 mol/L NaCl 稀釋 200 倍。
3、器材
試管 1.5×15 cm（×6）；
試管架；
移液管管 0.5 mL（×2）;1 mL（×2）;5 mL（×1）；
恒溫水浴；
分光光度計(jì)。
四、操作方法
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線
取 7 支試管，按下表平行操作。
搖勻，1 h 內(nèi)以 0 號(hào)管為空白對(duì)照，在 595 nm 處比色。
繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以 A595 nm 為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
2、未知樣品蛋白質(zhì)濃度測(cè)定
測(cè)定方法同上，取合適的未知樣品體積，使其測(cè)定值在標(biāo)準(zhǔn)曲線的直線范圍內(nèi)。根據(jù)所測(cè)定的 A595 nm 值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出其相當(dāng)于標(biāo)準(zhǔn)蛋白的量，從而計(jì)算出未知樣品的蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）。
五、注意事項(xiàng)
（1）在試劑加入后的 5-20 min 內(nèi)測(cè)定光吸收，因?yàn)樵谶@段時(shí)間內(nèi)顏色是最穩(wěn)定的。
（2）測(cè)定中，蛋白-染料復(fù)合物會(huì)有少部分吸附于比色杯壁上，測(cè)定完后可用乙醇將藍(lán)色的比色杯洗干凈。
（3）利用考馬斯亮藍(lán)法分析蛋白必須要掌握好分光光度計(jì)的正確使用，重復(fù)測(cè)定吸光度時(shí)，比色杯一定要沖洗干凈，制作蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的時(shí)候，蛋白標(biāo)準(zhǔn)品最好是從低濃度到高濃度測(cè)定，防止誤差。
一、實(shí)驗(yàn)原理
BCA檢測(cè)法是Lowry測(cè)定法的一種改進(jìn)方法。與Lowry方法相比，BCA法的操作更簡(jiǎn)單，試劑更加穩(wěn)定，幾乎沒(méi)有干擾物質(zhì)的影響，靈敏度更高（微量檢測(cè)可達(dá)到0.5μg/ml），應(yīng)用更加靈活。蛋白質(zhì)分子中的肽鍵在堿性條件下能與Cu2+絡(luò)合生成絡(luò)合物，同時(shí)將Cu2+還原成Cu+。二喹啉甲酸及其鈉鹽是一種溶于水的化合物，在堿性條件下，可以和Cu+結(jié)合生成深紫色的化合物，這種穩(wěn)定的化合物在562nm處具有強(qiáng)吸收值，并且化合物顏色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度成正比。故可用比色的方法確定蛋白質(zhì)的含量。
二、該方法的優(yōu)點(diǎn)
(一) 操作簡(jiǎn)單，快速，45分鐘內(nèi)完成測(cè)定，比經(jīng)典的Lowary法快4倍且更加方便；
(二) 準(zhǔn)確靈敏，試劑穩(wěn)定性好，BCA試劑的蛋白質(zhì)測(cè)定范圍是20-200μg/ml，微量BCA測(cè)定范圍在0.5-10μg/ml。
(三) 經(jīng)濟(jì)實(shí)用，除試管外，測(cè)定可在微板孔中就進(jìn)行，大大節(jié)約樣品和試劑用量；
(四) 抗試劑干擾能力比較強(qiáng)，如去垢劑，尿素等均無(wú)影響 。
三、實(shí)驗(yàn)材料
1.實(shí)驗(yàn)器材
721分光光度計(jì)；
恒溫水浴槽；
移液管；
微量進(jìn)樣器；
試管架和試管。
2.實(shí)驗(yàn)試劑
(1) BCA試劑的配制 ① 試劑A，1L：分別稱(chēng)取10g BCA (1%)，20g Na2CO3·H2O (2%)，1.6g Na2C4H4O6·2H2O(0.16%)，4g NaOH (0.4%) ，9.5g NaHCO3 (0.95) ，加水至1L，用NaOH或固體NaHCO3調(diào)節(jié)pH值至11.25。② 試劑B，50ml：取2g CuSO4·5H2O (4%)，加蒸餾水至50ml。③ BCA試劑：取50份試劑A與1份試劑B混合均勻。此試劑可穩(wěn)定一周。
(2)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：稱(chēng)取40mg牛血清白蛋白，溶于蒸餾水中并定容至100ml，制成400μg/ml的溶液。
(3)樣品溶液：配制約50μg/ml的牛血清白蛋白溶液作為樣品。
四、實(shí)驗(yàn)方法
方法一：96 孔板
1. 配制 BCA 工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液。充分混勻。
2. 將蛋白標(biāo)準(zhǔn)品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中。加滅菌雙蒸水補(bǔ)足到 10 μL。取 10 μL 待測(cè)樣品加入 96 孔板的待測(cè)樣品孔中。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。
3. 向待測(cè)樣品孔和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即樣品與工作液的體積比為 1:20），混勻。
4. 37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
5. 酶標(biāo)儀 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
6. 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。從標(biāo)準(zhǔn)曲線中求出樣品濃度。
方法二：試管法
1. 配制工作液：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品數(shù)量，按 50 體積試劑 A，1 體積試劑 B 配制適量 BCA 工作液，充分混勻。工作液配制的量要與測(cè)定所用的比色杯對(duì)應(yīng)。每個(gè)測(cè)定要做 2～3 個(gè)平行。本處列舉的比色體系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯規(guī)格不同，體系需要放大到實(shí)驗(yàn)將采用的比色杯準(zhǔn)確讀數(shù)所需要的體積。
2. BSA 標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的準(zhǔn)備：樣品用水或其它不干擾顯色反應(yīng)的緩沖液配制，使待測(cè)定的濃度位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分。每個(gè)反應(yīng)準(zhǔn)備 3 個(gè)平行測(cè)定。標(biāo)準(zhǔn)曲線一般 5~6 個(gè)點(diǎn)即可。根據(jù)樣品的估測(cè)濃度確定各點(diǎn)的具體濃度。稀釋 BSA 時(shí)可以用水或與樣品一致的溶液。如待測(cè)樣品的濃度約為 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 標(biāo)準(zhǔn)品、樣品及 BCA 工作液。
3. 取適量體積的標(biāo)準(zhǔn)蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混勻。37 ℃ 溫浴 30 min。冷卻至室溫。
4. 將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品在 562 nm 波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。
紫外分光光度計(jì)法
一、實(shí)驗(yàn)原理
這種方法是在280nm波長(zhǎng)，直接測(cè)試蛋白。選擇Warburg 公式，光度計(jì)可以直接顯示出樣品的濃度，或者是選擇相應(yīng)的換算方法，將吸光值轉(zhuǎn)換為樣品濃度。蛋白質(zhì)測(cè)定過(guò)程非常簡(jiǎn)單，先測(cè)試空白液，然后直接測(cè)試蛋白 質(zhì)。從而顯得結(jié)果很不穩(wěn)定。蛋白質(zhì)直接定量方法，適合測(cè)試較純凈、成分相對(duì)單一的蛋白質(zhì)。紫外直接定量法相對(duì)于比色法來(lái)說(shuō)，速度快，操作簡(jiǎn)單；但是容易受 到平行物質(zhì)的干擾，如DNA的干擾；另外敏感度低，要求蛋白的濃度較高。
二、結(jié)果計(jì)算
（1）簡(jiǎn)易經(jīng)驗(yàn)公式
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = [1.45*OD280-0.74*OD260 ] * Dilution factor
（2）精確計(jì)算
通過(guò)計(jì)算OD280/OD260的比值，然后查表得到校正因子F，再通過(guò)如下公式計(jì)算最終結(jié)果：
蛋白質(zhì)濃度(mg/ml) = F *(1/d) *OD 280 * D
其中d為測(cè)定OD值比色杯的厚度
D為溶液的稀釋倍數(shù)
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