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高效液相色譜外標(biāo)法含量計(jì)算注意事項(xiàng)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-02-21
核心提示:HPLC法在研究中的應(yīng)用就是含量測定了,HPLC法應(yīng)用于含量測定時(shí)哪些需要注意的問題?外標(biāo)法含量計(jì)算方式有哪些注意事項(xiàng)是必知的?
HPLC法在研究中的應(yīng)用就是含量測定了,HPLC法應(yīng)用于含量測定時(shí)哪些需要注意的問題?外標(biāo)法含量計(jì)算方式有哪些注意事項(xiàng)是必知的?

除鑒別和有關(guān)物質(zhì)檢查外,HPLC法在化學(xué)藥物中的應(yīng)用就是含量測定了,另外在制劑的含量均勻度、溶出度、釋放度檢驗(yàn)項(xiàng)目中,HPLC法也發(fā)揮著越來越重要的作用,但其本質(zhì)與含量測定一樣,都是準(zhǔn)確定量的測定方法,因此,含量測定也包括含量均勻度、溶出度、釋放度等定量檢測項(xiàng)目。

1、HPLC法應(yīng)用于含量測定時(shí)需要注意的問題
在建立一個(gè)新的HPLC法含量測定方法時(shí),方法建立以及方法學(xué)驗(yàn)證方案需要特別考慮下述多種因素對分析結(jié)果的影響。

(1)流動相緩沖鹽的pH值
流動相緩沖鹽的pH值對藥物的保留行為有影響,甚至?xí)@著改變某些堿性藥物的保留行為。見下圖1,當(dāng)流動相中緩沖溶液的pH為3.0時(shí),出峰順序?yàn)槔嗫ㄒ颉⒈郊柞0、酮洛芬,?dāng)流動相中緩沖溶液的pH為10.0時(shí),三種藥物的出峰順序?yàn)橥宸、苯甲酰胺、利多卡因二即使是梯度洗脫,流動相中緩沖溶液的pH值仍然對藥物的保留行為產(chǎn)生影響。

(2)色譜柱
色譜柱的差異也會影響藥物的保留行為,即使是柱長、內(nèi)徑、粒徑相同的色譜柱,由于填料性質(zhì)的差異,藥物的保留時(shí)間、峰型有時(shí)會有較大差異。

(3)流動相組成
以多元維生素制劑的含量測定為例,某制劑中含有4種維生素:煙酰胺、維生素B6、維生素B2和維生素B1。如圖2所示,當(dāng)流動相中己烷磺酸鈉和庚烷磺酸鈉的相對比例由1:1變?yōu)?:6時(shí),不僅各組分的保留時(shí)間、峰形有變化,甚至峰3、峰4沒有實(shí)現(xiàn)分離。

2、含量的計(jì)算方式
HPLC的定量方法可以分為內(nèi)標(biāo)法和外標(biāo)法。在儀器發(fā)展的初期,由于進(jìn)樣重復(fù)性差。為了保證測定結(jié)果的準(zhǔn)確采用內(nèi)標(biāo)法較多。隨著自動進(jìn)樣裝置的發(fā)展,進(jìn)樣的重復(fù)性已經(jīng)足夠精密,從90年代開始,大部分的內(nèi)標(biāo)法已經(jīng)被外標(biāo)法取代。

但是,在藥典制劑品種中還有一定數(shù)量的HPLC含量測定方法采用內(nèi)標(biāo)法。除了尚未修訂以外,以前擔(dān)心的進(jìn)樣重復(fù)性已經(jīng)不是采用內(nèi)標(biāo)法的原因,主要是因?yàn)樗幤分苿┖繙y定中樣品回收率或樣品制備方法的回收率影響,供試品溶液在萃取、離心處理或其他樣品溶液制備過程中不能保證樣品的完全提取,以及輔料對低含量藥物的吸附作用,采用內(nèi)標(biāo)法可避免因供試品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。

3、外標(biāo)法含量計(jì)算方式注意事項(xiàng)
外標(biāo)法含量計(jì)算公式:含量=m對*P*A樣*V樣/(m樣*A對*V對)*100%

(1)樣品稱樣量
a、稱量方式采用的是加量法還是減量法,都是很有講究的。正常情況下,肯定要采用加量法,一次稱取到位,這樣才能得到準(zhǔn)確的稱樣量。

b、稱量操作稱量時(shí),是否足夠小心,不會在轉(zhuǎn)移樣品時(shí)使樣品撒漏,這個(gè)是非常重要的。

c、樣品如果具有揮發(fā)性,直接稱樣時(shí),必然會揮發(fā)一部分造成誤差;另外,如果樣品不穩(wěn)定,或在溶液中不穩(wěn)定,那么實(shí)際上來講,也是影響了樣品量。還有,樣品要保證均勻,固體不必說,液體樣品要保證是均相,稱量之前要搖勻。

(2)對照品含量
a、對照品質(zhì)量對照品是否有合法來源,其含量值是否準(zhǔn)確。

b、對照品的保存對照品是否按要求保存,也是至關(guān)重要的。因?yàn)槿绻麑φ掌窙]有按照規(guī)定保存,那么其右可能會發(fā)生降解,進(jìn)而影響含量值;另外,如果對照品是保存在冰箱中,稱量時(shí),應(yīng)取出放在干燥器中回至室溫再稱量,否則其很有可能會吸收空氣中的水分,影響含量值。同理,如果對照品引濕性很強(qiáng)的話,長期暴露在空氣中,也會使其P發(fā)生變化。

(3)樣品峰面積
a、如果所用的分析方法可靠性不好,樣品峰面積或保留時(shí)間容易變化,那么檢測結(jié)果也是很重現(xiàn)性不好的。

b、如果儀器系統(tǒng)被污染產(chǎn)生殘留,而本身峰面積就不大的情況下,這個(gè)因素產(chǎn)生的誤差就更明顯了。

c、如果樣品峰形不夠好,或者分離度不夠好的情況下,積分就很重要。

(4)樣品的稀釋體積
a、容量瓶、移液管等體積是否準(zhǔn)確。一般來說,新買的容量瓶體積是符合要求的,但是也難免會買到個(gè)別次品,這就需要進(jìn)行校驗(yàn)了。

b、容量瓶、移液管規(guī)格。這個(gè)是很重要的,一般大家都能注意這個(gè)問題,做到合理使用。

c、試驗(yàn)習(xí)慣問題,容量瓶在使用時(shí),不能使其至于高于40攝氏度的環(huán)境下,否則容量瓶會發(fā)生變形。

d、定量操作,這個(gè)包括容量瓶和移液管的使用,注意事項(xiàng):
一是移液管吸液時(shí),液面不要高刻度太多,放液時(shí)千萬不要用洗耳球吹,并且盡量保持每次操作時(shí)間都一樣,粘度大的溶液尤其需要如此。
二是觀察液面時(shí),要使容量瓶和移液管保持垂直,這時(shí)很多人喜歡用三根手指捏住,其實(shí)這樣不容易保持垂直,最好用兩根手指,輕輕捏住就好。
三是注意接觸容量瓶移液管等的面積越小越好,以免體溫加熱溶液。

e、如果對照品和樣品沒有用同一份稀釋劑稀釋的話,兩者就會有差異,受到溫度變化的影響也是不一樣的。比如,所用的稀釋劑為水:甲醇=50:50,對照溶液用的是上次配好的,然后樣品用的是新配的,因?yàn)樗图状蓟旌蠒艧,其體積也會增大,等到進(jìn)樣時(shí),樣品溶液回至室溫,體積減小,就會造成檢測結(jié)果偏高。

f、如果前后室溫變化的話,也會造成分析結(jié)果的誤差。比如,對照溶液進(jìn)樣時(shí),是正常上班時(shí)間,實(shí)驗(yàn)室開了空調(diào),溫度為20℃,而到樣品溶液進(jìn)樣時(shí),已經(jīng)到下班時(shí)間了,實(shí)驗(yàn)室人員下班時(shí)將空調(diào)關(guān)閉,實(shí)驗(yàn)室溫度已經(jīng)降為10℃,這時(shí)樣品溶液濃度肯定也會增大。

g、由于對照品相對比較貴重,一般實(shí)驗(yàn)室都會保存一段時(shí)間。如果下次分析時(shí)沒有回至室溫,或此時(shí)室溫與對照品溶液配制時(shí)的溫度已經(jīng)發(fā)生了明顯的變化,都會造成分析結(jié)果的誤差。

h、有些人配好樣品后,喜歡用手去握著容量瓶,細(xì)心觀察的就會發(fā)現(xiàn)一會之后液面就明顯高于刻度。如果操作者沒有注意這點(diǎn),有的樣品立即進(jìn)樣,有的排隊(duì)過了一會再進(jìn)樣,就會造成誤差。


文章(文字)來源:網(wǎng)絡(luò) 
編輯:songjiajie2010

 
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