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黃曲霉毒素具有較強(qiáng)的毒害作用，可誘發(fā)肝、腎、肺、胃等部位的癌變，黃曲霉毒素B1被公認(rèn)為是目前致癌力最強(qiáng)的天然物質(zhì)。
藥材、飲片及制劑在貯藏、制備、運(yùn)輸過程中，如保存不當(dāng)，就會有受潮霉變而污染黃曲霉毒素的可能。
因此，各藥典都將黃曲霉毒素列為很重要的安全性指標(biāo)，中國藥典和歐洲藥典對多種中藥材都都建立了黃曲霉素檢查指標(biāo)，美國藥典對植源性的藥品也要求檢查黃曲霉毒素……
今天小編就詳細(xì)介紹中國藥典、歐洲藥典和美國藥典的黃曲霉毒素測定方法，總結(jié)出各藥典的差異，并列出詳細(xì)的檢驗(yàn)方法，供各位參考。
1、比較中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的檢查方法
1、比較中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的檢查方法
各藥典中方法號、限度、適用范圍等列表如下，由此可見，各藥典收載的檢測方法不同、限度不同，最嚴(yán)格的當(dāng)屬歐洲藥典。
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對比內(nèi)容 |
中國藥典 |
美國藥典 |
歐洲藥典 |
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依據(jù) |
通則2351真菌毒素測定法 |
GENERAL CHAPTERS<561> ARTICLES OF BOTANICAL ORIGIN |
2.8.18 DETERMINATION OF AFLATOXIN B1 IN HERBAL DRUGS |
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方法 |
第一法 |
HPLC法 |
TLC法 |
HPLC法 |
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第二法 |
HPLC-MS法 |
薄層掃描法 |
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第三法 |
酶聯(lián)免疫法 |
HPLC法 |
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限度 |
每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg ，總量不得過 10μg。 |
每1000g含黃曲霉毒素B1不得過5μg，總量不得過20μg。 |
每1000g含黃曲霉毒素B1不得過2μg，總量不得過4μg。 |
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說明 |
中國藥典的三種方法都可以使用，當(dāng)測定結(jié)果超出限度時(shí)，采用第二法進(jìn)行確認(rèn)。 |
首先使用第一法，第一法系統(tǒng)適用性不通過才會使用第二法或第三法。 |
只有一種方法，適用于devil’s claw root, ginger and senna pods，用于其他品種需要驗(yàn)證適用性。 |
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注：總量為黃曲霉毒素B1（AFB1）、黃曲霉毒素B2（AFB2）、黃曲霉毒素G1（AFG1）和黃曲霉毒素G2（AFG2）的總量。
2、詳解中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的HPLC方法
2、詳解中國藥典、美國藥典、歐洲藥典的HPLC方法
黃曲霉毒素檢查方法中，唯一同時(shí)適用于三家藥典的方法，只有HPLC法（熒光檢測器），而且光化學(xué)檢測器與HPLC-熒光檢測器配套使用，在線對黃曲霉毒素B1、G1進(jìn)行衍生，不需要任何化學(xué)試劑，應(yīng)用范圍較廣，因此本文重點(diǎn)比較此法在各藥典中的異同。
從以下幾部分可以看出，色譜柱、流動(dòng)相、流速、波長、供試品和對照品的配制方法、進(jìn)樣量等內(nèi)容都存在較大差異，需要謹(jǐn)慎對照使用。
2.1 中國藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
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檢驗(yàn)方法 |
具體內(nèi)容 |
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色譜柱 |
十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑 |
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流動(dòng)相 |
甲醇-乙腈-水(40 : 18 : 42) |
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流速 |
1.0ml/min |
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柱后衍生化 |
光化學(xué)衍生器（254nm） |
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檢測器 |
熒光檢測器，激發(fā)波長360nm (或365nm)，發(fā)射波長450nm。 |
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系統(tǒng)適用性 |
兩個(gè)相鄰色譜峰的分離度應(yīng)大于1.5；需確認(rèn)回收率應(yīng)在60~120%，線性回歸的相關(guān)系數(shù)應(yīng)不低于0.990； |
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混合對照品溶液 |
精密量取黃曲霉毒素混合對照品溶液（黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2 標(biāo)示濃度分別為 1.0μg/ml、0. 3μg/ml、l.0μg/ml、0.3μg/ml）0.5ml，置10ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液l ml，置25ml量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得。 |
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供試品溶液 |
取供試品粉末約15g（過二號篩），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3g，精密加入70%甲醇溶液75ml, 高速攪拌2 分鐘（攪拌速度大于11000 r/min），離心 5 分鐘（離心速度4000r/min），精密量取上清液15ml, 置50ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，離心 10分鐘（離心速度4000r/min)，精密量取上清液20ml，通過免疫親合柱，流速每分鐘3ml, 用水20ml洗脫(必要時(shí)可以先用淋洗緩沖液10ml洗脫，再用水10ml洗脫），棄去洗脫液，使空氣進(jìn)人柱子，將水?dāng)D出柱子，再用適量甲醇洗脫, 收集洗脫液，置 2ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0. 22μm)濾過，取續(xù)濾液，即得。 |
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進(jìn)樣量 |
混合對照品溶液5μ1、10μ1、15μ1、20μ1、25μ1；供試品溶液20~50μl。 |
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定量方法 |
測定各對照品溶液的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；測定供試品溶液的峰面積，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的量，并計(jì)算出四者總和。 |
2.2 美國藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
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檢驗(yàn)方法 |
具體內(nèi)容 |
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色譜柱 |
4.6-mm×15 cm，3-μm填料L1（即十八烷基硅烷鍵合硅膠） |
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流動(dòng)相 |
水-甲醇-乙腈（60:25:15） |
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流速 |
0.8 mL/min |
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檢測器 |
熒光檢測器，激發(fā)波長362nm，發(fā)射波長440nm |
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系統(tǒng)適用性 |
洗脫順序?yàn)锳FG2、AFG1、AFB2和AFB1； 將5號線性對照溶液5ml加入到5g的樣品中，按“供試品溶液”（甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）用量為20ml）處理方法，計(jì)算AFB1（2μg/kg）和黃曲霉毒素（5μg/kg）的平均回收率，應(yīng)分別不低于68%和70%。AFB1和黃曲霉毒素總量的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）不高于10%。 |
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免疫親和柱預(yù)處理 |
免疫黃曲霉素柱的總黃曲霉毒素最小容量不低于100ng。將AFB1、AFB2、AFG1和AFG2每個(gè)5ng，溶于10mL 10%甲醇的磷酸鹽緩沖鹽溶液（v/v）中時(shí)，各回收率不低于80%。 |
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對照品溶液 |
用乙腈制備AFB1、AFB2、AFG1和AFG2分別含有2.0、0.50、2.0和0.50μg/ml的混合對照溶液。首先用乙腈制備標(biāo)示濃度均為10μg/ml的各儲備液，在360nm附近測定最大吸光度，計(jì)算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/ml）=（A×Mr×1000）/ε，其中A為吸光度，Mr為分子量，ε為摩爾吸收系數(shù)，見附表1。準(zhǔn)確量取一定量黃曲霉毒素各儲備液至同一容量瓶，用乙腈稀釋至規(guī)定濃度。冰箱儲存，使用前平衡至室溫。用甲醇-水（1:1）稀釋黃曲霉素對照溶液，最終濃度見附表2。冰箱保存，使用前平衡至室溫，每日新制。 |
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供試品溶液 |
取樣品5g，置于50ml離心管中，加入氯化鈉1 g和甲醇-0.5%碳酸氫鈉（7:3）25 mL。在渦流混合器上混合，直到樣品顆粒和提取溶劑充分混合，400 rpm振搖10min，7000 rpm離心10min，立即取7 mL至50 mL離心管中，加入0.1 M磷酸鹽緩沖溶液28 mL，混合，過濾，收集25ml濾液（相當(dāng)于1g樣品）到25ml刻度量筒中，并立即上IAC柱。[注：對于IAC柱在使用前必須在室溫下至少平衡15分鐘。]從小柱上取下頂蓋，并將其與儲液罐連接。從柱上拆下端蓋，并將其連接到柱歧管上（必須擰緊）。讓柱中的液體通過，直到液體高出柱床約2~3 mm。將濾液25ml倒入儲液罐。讓液體自然流過柱子，讓柱子流干。為了便于再次開始流動(dòng)，從歧管上取下色譜柱，向柱中加入磷酸鹽緩沖鹽溶液約2 mL，將色譜柱重新連接到儲液罐上，然后用磷酸鹽緩沖鹽溶液3ml和水5ml清洗色譜柱（如果使用其他技術(shù)去除柱末端的氣泡并很容易重新開始流動(dòng)，則可將磷酸鹽緩沖鹽溶液5ml直接加入到柱儲液罐中）。讓柱子流干，然后用注射器注入3ml空氣通過柱子，用甲醇1ml洗脫，并用3ml容量瓶中收集洗脫液，使洗脫液自由滴落。讓柱子流干。靜置1分鐘，然后用額外的甲醇1ml洗脫，并收集在同一容量瓶中。讓柱子流干，并注入10ml空氣通過柱子，用水稀釋洗脫液至刻度，立即進(jìn)行分析。 |
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進(jìn)樣量 |
50μ1 |
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定量方法 |
毒素（μg/kg）={[（R−a）/S]×V/W}×F R=樣品溶液的峰面積；a=校準(zhǔn)曲線的y截距；S=校準(zhǔn)曲線的斜率；V=樣品溶液的最終體積（mL）；W=通過免疫柱的供試品1g；F=稀釋系數(shù)，V=3 mL時(shí)為1；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.3 歐洲藥典中黃曲霉毒素檢查方法（HPLC法）
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檢驗(yàn)方法 |
具體內(nèi)容 |
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色譜柱 |
柱長0.25m，直徑4.6mm，十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相（5-μm） |
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流動(dòng)相 |
乙腈-甲醇-水(2:3:6) |
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流速 |
1.0ml/min |
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柱后衍生化 |
光化學(xué)衍生器（254nm） |
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檢測器 |
熒光檢測器檢測，激發(fā)波長= 365nm，發(fā)射波長Aem =435nm。 |
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系統(tǒng)適用性 |
出峰順序：G2、G1、B2、B1；需滿足驗(yàn)證要求。 |
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對照品溶液 |
用甲苯-乙腈(98:2)制備10μg/mLAFB1貯備溶液，并在330nm~370nm波長范圍內(nèi)測定吸收曲線，計(jì)算公式為：黃曲霉毒素濃度（μg/mL）=（A×M×100）/ε，其中A為紫外吸收曲線上的最大吸光度，M為B1的分子量（312g/mol），ε為摩爾吸收系數(shù)（1930m2/mol）。用甲苯-乙腈(98:2)將初級貯備液稀釋為100ng/mL的次級貯備液，用鋁箔緊密包好后，置于4℃儲存，使用前，待溶液恢復(fù)至室溫后才能取下鋁箔。使用前后記錄容量瓶的重量。按附表3制備系列對照溶液，將所需體積的次級貯備液置于250ml容量瓶中，氮?dú)獯蹈桑尤爰状?5ml溶解黃曲霉毒素B1，并用水稀釋至刻度。 |
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免疫親和柱預(yù)處理 |
免疫親和柱對黃曲霉毒素B1的容量不低于100 ng。將AFB1 5 ng，溶于12.5ml甲醇和87.5 mL 水中時(shí)，回收率不低于80%。使用前平衡至室溫。 |
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供試品溶液 |
取本品粉末5.00g，加入甲醇:水(70:30)混合溶液100ml，超聲處理30min，取濾液10ml至150ml錐形瓶，并加入水70ml。取40ml以流速3ml/min（不得超過5ml/min）通過免疫親和柱。用水以流速5ml/min沖洗小柱兩次，每次10ml.用注射器注入空氣10s。取甲醇5ml注入小柱，并保持自然流出，收集洗脫液至5ml容量瓶中，1min后，注入甲醇0.5ml ，再隔1min后，注入甲醇0.5ml，每次加入甲醇后，均通過注入空氣收集洗脫液，用水稀釋至容量瓶刻度，搖勻。溶液澄清的話，可直接用于分析；否則應(yīng)過濾處理，并確保黃曲霉毒素沒有損失。 |
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進(jìn)樣量 |
500μ1 |
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定量方法 |
用黃曲霉毒素B1系列對照溶液1~5做標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品濃度超出線性范圍，則需要做相應(yīng)稀釋。 毒素（μg/kg）=[（R−b）/a]×V /W R=樣品溶液的峰面積；b=校準(zhǔn)曲線的截距；a=校準(zhǔn)曲線的斜率；V稀釋倍數(shù)；W=通過免疫柱的供試品g；黃曲霉毒素的總量是AFG1、AFG2、AFB1和AFB2的總和。 |
2.4 上述方法中的三個(gè)附表
附表1
|
黃曲霉毒素 |
M |
溶劑 |
ε |
|
AFB1 |
312 |
乙腈 |
20700 |
|
AFB2 |
314 |
乙腈 |
22500 |
|
AFG1 |
328 |
乙腈 |
17600 |
|
AFG2 |
33 |
乙腈 |
18900 |
附表2
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序號 |
黃曲霉素對照溶液加入量(μl) |
黃曲霉素工作對照溶液（ng/ml） |
||||
|
AFB1 |
AFB2 |
AFG1 |
AFG2 |
總和 |
||
|
1 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
0 |
|
2 |
12.5 |
0.25 |
0.0625 |
0.25 |
0.0625 |
0.625 |
|
3 |
25 |
0.5 |
0.125 |
0.5 |
0.125 |
1.25 |
|
4 |
50 |
1 |
0.25 |
1 |
0.25 |
2.5 |
|
5 |
100 |
2 |
0.5 |
2 |
0.5 |
5 |
|
6 |
200 |
4 |
1 |
4 |
1 |
10 |
附表3
|
系列對照溶液 |
加入次級貯備液的體積(μl) |
對照溶液的最終濃度(ng/ml) |
|
1 |
125 |
0.05 |
|
2 |
250 |
0.1 |
|
3 |
500 |
0.2 |
|
4 |
750 |
0.3 |
|
5 |
1000 |
0.4 |
3、注意事項(xiàng)
3、注意事項(xiàng)
文章（文字）來源：網(wǎng)絡(luò)。
