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大腸菌群檢測知識及MPN法檢測的注意要點

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2023-12-01
核心提示: 一、大腸菌群的定義1、指一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2、該菌群主
 一、大腸菌群的定義

1、指一群在36℃條件下培養(yǎng)48h能發(fā)酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。

2、該菌群主要來源于人畜糞便, 作為糞便污染指標評價食品的衛(wèi)生狀況, 推斷食品中腸道致病菌污染的可能。

3、大腸菌群不是細菌學上分類命名,而是一組與糞便污染有關的細菌。這群細菌包括:大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌。

4、生化特征及血清學反應并非完全一致。

5、典型大腸桿菌的IMVIC與硫化氫試驗結果:++---。

 

二、分布

1、廣泛分布于自然環(huán)境。

2、來源于人和溫血動物的糞便。

 

三、衛(wèi)生學意義

1、大腸菌群作為糞便污染的指標菌評價樣品中是否受到糞便的污染。

 

2、大腸菌群計數的高低,直接反映了樣品受糞便污染的程度。

3、表示對人體健康是否具有潛在的危險性。

大腸菌群是理想的糞便污染的指標菌

4、是人類和溫血動物腸道菌群,在數量上占優(yōu)勢。

5、隨糞便排出體外后,在外界環(huán)境影響下,其存活時間應與腸道致病菌大致相似或稍長。

6、檢驗方法簡便,易于檢出與計數。

7、對消毒劑的抵抗力應不低于腸道致病菌。

 

四、大腸菌群檢驗MPN法接種量剖析

接種量問題,GB 4789.3 -2016中 7.2 初發(fā)酵試驗規(guī)定“選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液,每個稀釋度接種3管LST肉湯,每管接種1mL(如超過1mL,則用雙料LST)”。這里所說的接種量1mL并非1mL樣品接種量(即MPN檢索表中的1mL樣品接種量),而是接種的稀釋液的體積V=1mL(為了區(qū)分,本文中用V表示),那么實際的接種量m(為了區(qū)分,本文中用m來表示)為m×p(p為稀釋液濃度)。那么括號中的接種量超過1mL就是要V>1mL,而MPN檢索表中的實際接種量都為10-n系列數,所以V也只可能是10mL(100mL在實際中不可能),也就是說接種體積V=1mL,用單料,V=10mL用雙料。

 

例如:25g樣品+225mL緩沖液—1:10稀釋液

   1:10稀釋液+9mL緩沖液—1:100稀釋液

若:1:10稀釋液接種10mL至雙料LST,接種量為:10mL×0.1g/mL=1g

1:10稀釋液接種1 mL至單料LST,接種量為:1mL×0.1g/mL=0.1g

1:100稀釋液接種1 mL至單料LST,接種量為:1mL×0.01g/mL=0.01g

培養(yǎng)基裝量在GB 4789.3-2016中沒有作任何說明,所以各人的理解更是不一,可能有的人單雙料都用10mL,有的人用9mL,有的更多或更少。那么到底培養(yǎng)基裝量有沒有什么規(guī)則,是不是怎樣都行?

 

其實不是,GB/T 5750.12—2006中總大腸菌群檢測方法中2.1.5.1.1中使用的是單料雙料都是10mL,這實際上是為了使得接種稀釋液后所有的發(fā)酵管培養(yǎng)基濃度達到培養(yǎng)基本身的使用濃度。雙料10mL,再接種10mL稀釋液后濃度降低一倍就還原了培養(yǎng)基本身的使用濃度,而單料它本身就是培養(yǎng)基的使用濃度,那么接種1mL稀釋液后為了使培養(yǎng)基的濃度不至降低太多,就要讓培養(yǎng)基裝量盡可能的多,但是試管的裝量也是有限度的,所以選擇裝量在10mL左右比較合適。

 

 

五、大腸菌群檢驗MPN法注意事項及要點

1、MPN法注意事項:

 

•全過程不得超過15min。

•樣品勻液的pH值應在6.5~7.5之間,

•(如接種量需要超過1mL,則用雙料LST肉湯)

•以48h±2h為最終觀察結果時限。結果也以此時為最終結果。

 

2、MPN法培養(yǎng)基:LST、BGLB:

 

1)月桂基磺酸鹽胰蛋白胨(LST)

月桂基磺酸鈉能抑制革蘭氏陽性菌的生長,同時比膽鹽的選擇性和穩(wěn)定性好。由于膽鹽與酸產生沉淀,沉淀有時候會使對產氣情況的觀察變得有些困難;

•乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌;

•胰蛋白胨提供基本的營養(yǎng)成分;

•LST肉湯是國際上通用的培養(yǎng)基,與乳糖膽鹽肉湯的作用和意義相同,但具有更多的優(yōu)越性。

•發(fā)酵試驗判定原則:產氣為陽性。

•檢測步驟減少(不必分離培養(yǎng)),檢測時間縮短24h。

•注:如接種量超過1mL,則應用雙料LST肉湯

2)煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)

膽鹽可抑制革蘭氏陽性菌。

•煌綠是抑菌抗腐劑,可增強對革蘭氏陽性菌的抑制作用。

•乳糖是大腸菌群可利用發(fā)酵的糖類。有利于大腸菌群的生長繁殖并有助于鑒別大腸菌群和腸道致病菌。

•發(fā)酵試驗判定原則:產氣為陽性。由于配方里有膽鹽,膽鹽遇到大腸菌群分解。

•乳糖所產生的酸形成膽酸沉淀,培養(yǎng)基可由原來的綠色變?yōu)辄S色,同時可看到管底通常有沉淀。

 

3、MPN檢索表的應用:

MPN(最可能數most probable number)是表示樣品中活菌密度的估測。因此MPN值只是活菌密度的估算值,并不是樣品中活菌數的真值。

 

4、使用MPN檢索表的注意點:

 

•這個MPN檢索表是ISO、FDA、AOAC、USDA/FSIS、北歐等標準通用的。

•表里的數字是有小數點的。

•報告單位不同,F報告單位為g/ml,而原報告單位是100g/ml。

•原標準MPN表有64個組合,而現標準MPN表只有40個組合。

當實驗結果在MPN表中無法查找到MPN值時,如:陽性管數為122,123,232,233等時,建議增加稀釋度(可做4~5個稀釋度),使樣品的最高稀釋度能達到獲得陰性終點(如果污染程度不能判定,則多加一稀釋度),然后再遵循相關的規(guī)則進行查找,最終確定MPN值。

 

編輯:songjiajie2010

 
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