通過(guò)對(duì)熒光光譜的研究，可以獲得蛋白質(zhì)分子中熒光生色基團(tuán)的種類、結(jié)構(gòu)和所處微環(huán)境及其分布情況等有用信息，同時(shí)還可以得到外源物質(zhì)與生物大分子相互作用的有關(guān)數(shù)據(jù)。目前已有多篇文獻(xiàn)采用熒光光譜法研究藥物分子如槲皮素[3 ] 、甲基硫菌靈[4 ] 等與血清白蛋白的相互作用。

 

      核黃素(Riboflavin ，RI) 又稱維生素B2 ，是人體必需的13 種維生素之一，具有促進(jìn)發(fā)育和細(xì)胞的再生；促使皮膚、指甲、毛發(fā)的正常生長(zhǎng)；消除口腔內(nèi)、唇、舌的炎癥；減輕眼睛的疲勞增進(jìn)視力，協(xié)助代謝碳水化合物、脂肪、蛋白質(zhì)等多種功能。同時(shí)還具有利尿消腫，防治腫瘤，降低心腦血管病的發(fā)生等保健功效。

 

      本文采用熒光光譜法研究了核黃素與牛血清白蛋白(BSA) 間的相互作用，探討了核黃素與BSA 作用機(jī)制，計(jì)算得到熒光猝滅常數(shù)，以及與BSA 作用的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)等信息。

 

      1 　實(shí)驗(yàn)部分

 

      1. 1 　試劑與儀器

 

      RF25301 型熒光分光光度計(jì)(日本，島津公司) ；UV28453 型紫外分光光度計(jì)(日本，日立公司) ； TB285型恒溫水浴(日本，島津公司) ；p HSJ24A p H 計(jì)(上海雷磁儀器廠) 。

 

      牛血清白蛋白(Amresco. 0930 ，分子量:65 000) ；核黃素(中國(guó)藥品生物制品檢定所) ；p H = 7. 40 的Tris2HCl 緩沖溶液；以Tris2HCl 緩沖溶液為溶劑配制1. 0 ×10 - 3 mol•L - 1 的BSA 標(biāo)準(zhǔn)溶液，1. 0 ×10 - 3mol•L - 1 核黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液，兩種標(biāo)準(zhǔn)溶液均在0～4 ℃冰箱中保存。實(shí)驗(yàn)所需濃度由此稀釋而得。Tris ，HCl ，NaCl均為分析純；水為雙重蒸餾水_。

 

      1. 2 　實(shí)驗(yàn)方法

 

      在10 mL 比色管中依次加入p H = 7. 40 的Tris2HCl 緩沖溶液2 mL ，1. 0 ×10 - 3 mol/ L BSA 溶液0. 5mL 以及一定量核黃素溶液，用0. 1 mol/ L NaCl水溶液稀釋至刻線后混勻，在實(shí)驗(yàn)溫度下恒溫1 h ，采用1 cm石英池，激發(fā)波長(zhǎng)為285 nm ，繪制300～450 nm 的熒光光譜，并分別以△λ= 60 nm 和△λ= 15 nm 掃描其同步熒光光譜，測(cè)定時(shí)入射狹縫均為10 nm ，出射狹縫均為5 nm。

 

      2 　結(jié)果與討論

 

      2. 1 　熒光猝滅光譜

 

      按照實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定不同溫度條件下BSA 溶液中加入不同量核黃素的熒光光譜(圖1) 。

 

      由于蛋白質(zhì)中存在色氨酸和酪氨酸，使其具有內(nèi)源熒光，由圖1 可知:當(dāng)固定BSA 的量，隨著核黃素濃度的增加，BSA 的熒光強(qiáng)度不斷降低，熒光峰逐漸藍(lán)移，說(shuō)明核黃素與BSA 發(fā)生了相互作用，這種作用可能引起B(yǎng)SA 中熒光發(fā)色團(tuán)的微環(huán)境及蛋白質(zhì)分子構(gòu)象行為的變化[5 ] 。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)在293 K 和310 K條件下加入核黃素的濃度與BSA 熒光猝滅值△F( △F = F0 - F， F、F0 分別指有無(wú)RI 時(shí)的熒光強(qiáng)度) 分別在0～0. 6 ×10 - 5 mol/ L 、0～0. 4 ×10 - 5 mol/ L 范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，回歸系數(shù)R 分別為0. 9982 、0. 9938 ，該法可用于核黃素濃度的測(cè)定。

 

      2. 2 　熒光猝滅機(jī)理及結(jié)合常數(shù)的基本確定

 

      引起B(yǎng)SA 熒光猝滅的原因可能有動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩種。動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程遵循Stern2Volmer 方程[6 ] 。

 

      F0 / F = 1 KSV [Q ] = 1 Kqτ0 [Q ] (1)

 

      式中， F0 和F 分別表示不存在和存在猝滅劑物質(zhì)的熒光強(qiáng)度； [Q ]為猝滅劑的濃度， KSV為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)，Kq是由擴(kuò)散過(guò)程控制的雙分子動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)[7 ] 。τ0 為沒(méi)有猝滅劑存在下熒光分子平均壽命，生物大分子熒光壽命約為10 - 8 s[8 ] 。而靜態(tài)猝滅過(guò)程遵循下式:

 

      F0 / F = 1 KS [Q ] (2)

 

      式中， KS 是靜態(tài)猝滅常數(shù)。隨溫度的升高動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)會(huì)增大，而靜態(tài)猝滅常數(shù)隨之減小，可由此判斷熒光猝滅類型。

 

      根據(jù)Stern2Volmer 方程繪制不同溫度下的( F0 / F - 1) ～[Q ]曲線，結(jié)果顯示，隨溫度升高曲線斜率增大，表明猝滅機(jī)理為動(dòng)態(tài)猝滅。表1 為不同溫度核黃素對(duì)BSA 熒光猝滅的Stern2Volmer 方程及猝滅常數(shù)。各類猝滅劑對(duì)生物大分子的最大動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)約為2 ×1010 L•mol- 1 •s - 1 ，而從表1 結(jié)果來(lái)看，Kq數(shù)量級(jí)在1013 ( Kq= KSV /τ0 ) ，由此可知，猝滅機(jī)理似乎應(yīng)為靜態(tài)猝滅，但考慮到離子強(qiáng)度是影響猝滅系數(shù)的重要因素，實(shí)驗(yàn)采用0. 1 mol•L - 1NaCl 以控制溶液離子強(qiáng)度，我們認(rèn)為Kq的增大可能是離子強(qiáng)度影響的結(jié)果[9 ] 。

 

      為驗(yàn)證核黃素對(duì)BSA 熒光的猝滅機(jī)理，測(cè)定了1. 0 ×10 - 5 mol•L - 1 BSA (以去離子水為參比) 和核黃素與BSA等摩爾混合物的吸收光譜圖(以核黃素溶液作參比) ，兩者幾乎完全重合，表明核黃素的加入并未使BSA 的紫外吸收光譜發(fā)生變化。進(jìn)一步證實(shí)核黃素對(duì)BSA 熒光猝滅機(jī)理是其與BSA 激發(fā)態(tài)分子生成瞬時(shí)的激發(fā)態(tài)復(fù)合物的動(dòng)態(tài)猝滅過(guò)程而不是與BSA 在基態(tài)時(shí)生成不發(fā)光的配合物所產(chǎn)生的靜態(tài)猝滅過(guò)程[10 ] 。

 

      2. 3 　BSA 與核黃素結(jié)合反應(yīng)的熱力學(xué)性質(zhì)及作用力

 

      分子間的作用力包括氫鍵，范德華力，靜電引力，疏水作用力等。當(dāng)溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變△r Hm可認(rèn)為是常數(shù)。由熱力學(xué)公式In ( K2 / K1 ) = △r Hm(1/ T1 - 1/ T2 ) R ； △r Gm= RTInK； △rSm =( △r Hm- △r Gm) / T。分別計(jì)算出溫度為293 K，310 K 時(shí)，核黃素與BSA 作用的自由能變△r Gm、焓變△r Hm和熵變△r Sm分別為- 28. 80 kJ •mol- 1 ，4. 406 kJ •mol- 1 ，0. 113 kJ •mol- 1 及- 30. 732 kJ •mol- 1 ，4. 406 kJ •mol- 1 ，0. 113 kJ•mol- 1 。

 

      核黃素與BSA 的熱力學(xué)參數(shù)△r Hm> 0 和△r Sm> 0 ，根據(jù)Ross 等總結(jié)出的判斷生物大分子與小分子結(jié)合力性質(zhì)和生物大分子自身結(jié)合力性質(zhì)的熱力學(xué)規(guī)律[11 ] 推斷出核黃素與BSA 之間的主要作用力是疏水作用。

 

      2. 4 　核黃素與BSA 的表觀結(jié)合常數(shù)Kb 以及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n

 

      當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)其表觀結(jié)合常數(shù)Kb 與結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n 由下式求出:

 

      lg[ ( F0 - F) / F] = lgKb nlg[Q ]

 

      分別在293 K， 310 K溫度下做lg ( F0 - F) / F - lg[Q ]的雙對(duì)數(shù)圖，根據(jù)截距和斜率求得不同溫度的Kb 和n ，如表2 。

 

      由表2 可知，在293 K、310 K核黃素與BSA 的n 接近1 ， Kb 值為105 數(shù)量級(jí)，說(shuō)明核黃素與BSA 具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。核黃素與BSA 有較強(qiáng)的結(jié)合作用可以被蛋白質(zhì)運(yùn)輸和儲(chǔ)存。

 

      2. 5 　同步熒光光譜

 

      △λ= 15 nm 的同步熒光光譜只顯示酪氨酸殘基的光譜特征， △λ= 60 nm 的同步熒光光譜僅顯示色氨酸殘基的光譜特征[12 ] 。圖2 為固定BSA 濃度改變核黃素濃度所做的同步熒光光譜圖。由圖可知酪氨酸殘基，色氨酸殘基特征熒光光譜峰均隨著核黃素濃度增加產(chǎn)生猝滅，同時(shí)峰位值均發(fā)生了紅移，說(shuō)明酪氨酸殘基，色氨酸殘基所處的微環(huán)境疏水性降低，親水性增強(qiáng)。色氨酸殘基的熒光降低比酪氨酸殘基更顯著且與BSA 的熒光性質(zhì)相近，說(shuō)明BSA 的熒光主要由色氨酸殘基所貢獻(xiàn)，核黃素與BSA 的結(jié)合位點(diǎn)更接近于色氨酸殘基。