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使用UPLC-熒光/質(zhì)譜法分析2-AB標(biāo)記的多聚糖混合物

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2012-03-13  來(lái)源:沃特世科技(上海)有限公司
核心提示: 使用UPLC-熒光/質(zhì)譜法分析2-AB標(biāo)記的多聚糖混合物
 
蛋白質(zhì)糖基化是生命系統(tǒng)非常重要的翻譯后修飾之一,在免疫識(shí)別,蛋白分泌,信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。與蛋白相連的多聚糖是這些功能的重要載體,特別是對(duì)于單克隆抗體藥物,多聚糖部分對(duì)藥物的生物活性有著重要的影響。因此,發(fā)展分離效率高,檢測(cè)靈敏度好的糖基化分析方法對(duì)單克隆抗體藥物分析具有十分重要的意義。
 
針對(duì)糖基化分析中的種種困難,沃特世公司開發(fā)了親水作用色譜法,以及熒光-質(zhì)譜結(jié)合檢測(cè)的分析方法。ACQUITY UPLC系統(tǒng)配合熒光檢測(cè)器?(FLR)以及多聚糖分析專用(GST )色譜柱,比HPLC方法有更高的分離度。多聚糖分析專用色譜柱裝填了1.7μm的酰胺吸附劑,可在HILIC模式下有效分離熒光標(biāo)記的多聚糖。UPLC配合熒光檢測(cè)器®分析多聚糖可以獲得很高的分離度和定量準(zhǔn)確性,特別是對(duì)于位置異構(gòu)體以及有共流出的小峰分析;而質(zhì)譜檢測(cè)為糖鏈鑒定提供了更多的結(jié)構(gòu)信息。通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)糖鏈保留時(shí)間的比較,該流程能實(shí)現(xiàn)高通量的多聚糖定性定量,滿足藥物分析的多種需求。
 
一、色譜條件與標(biāo)記后的多聚糖樣品的分離
可通過(guò)HILIC方法,有效分離2-AB標(biāo)記的多聚糖混合物。對(duì)于方法優(yōu)化,使用更緩的窄梯度,可有效提高保留時(shí)間上相臨近的多聚糖峰之間的分離度;對(duì)于其它的參數(shù),如流速、緩沖液濃度、流動(dòng)相pH及柱溫等,一般也需要進(jìn)行優(yōu)化。圖1示例使用優(yōu)化后的HILIC色譜條件后,復(fù)雜的2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物得到了很好的分離,包括E1/ E2與F1/ F2。實(shí)驗(yàn)所用梯度洗脫時(shí)間為45分鐘,包括色譜柱清洗和再平衡步驟。一般來(lái)說(shuō),一個(gè)樣品的總分析時(shí)間在1小時(shí)內(nèi)。因此,與使用3.0-μm填料的HPLC方法相比,使用1.7-μm填料的UPLC色譜方法,不但分離效果更好,而且運(yùn)行時(shí)間更短。實(shí)驗(yàn)中使用2.1 x150 mm色譜柱。圖1(B)中甘露糖5(峰C)與甘露糖6(峰H)可與鄰近多聚糖峰成功分離,解決了共流出的問(wèn)題。
二、2-AB標(biāo)記的多聚糖定量及結(jié)構(gòu)鑒定
由于多聚糖在HILIC 模式下能實(shí)現(xiàn)基線分離,各種異構(gòu)體,例如末端唾液酸的位置異構(gòu),都能得到很好的分離。因此,在熒光檢測(cè)器下的峰面積積分能對(duì)各種糖鏈進(jìn)行定量分析。而從MS譜圖來(lái)看,多聚糖樣品中高甘露糖糖型所占比例較高,而復(fù)合型及雜合型糖鏈也都能夠得到鑒定。各種帶有神經(jīng)氨酸的糖鏈也都能得到鑒定,表明該方法能夠適合各種多聚糖復(fù)合物的分析。除了分子量,我們還能通過(guò)MS/MS譜圖進(jìn)一步確認(rèn)多聚糖的結(jié)構(gòu)。


 
2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物的分析結(jié)果充分說(shuō)明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案,且相應(yīng)色譜柱的質(zhì)量控制采用了2-AB標(biāo)記的IgG多聚糖混合物進(jìn)行。ACQUITYUPLC系統(tǒng)顯著縮短了分析時(shí)間,將常規(guī)HPLC上需要2個(gè)小時(shí)甚至3個(gè)小時(shí)的分離梯度縮短到1小時(shí)。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MS的整體解決方案可以十分有效的對(duì)多聚糖進(jìn)行分析,除提供分子量信息外,還可以進(jìn)行糖結(jié)構(gòu)推導(dǎo),大大降低了生物藥物研發(fā)工作中糖基化分析的難度。
 
實(shí)驗(yàn)流程:

一、2-AB 標(biāo)記糖鏈
使用GlycoPro  le試劑盒,Prozyme公司
使用試劑盒進(jìn)行2-AB 標(biāo)記糖鏈時(shí),除以下步驟,按照該公司的說(shuō)明操作即可。
1.使用50μl的標(biāo)記反應(yīng)液
2. 65度反應(yīng)4-5小時(shí)
3.將樣品按步驟4處理除掉過(guò)量的標(biāo)記試劑
 
使用Sigma公司試劑
1. 配制3 0% 的醋酸D M S O 溶液( 3 0 μ l 冰醋酸,700ulDMSO)
2.按照20:1(v/w)的比例配制2-AB 溶液 (如需要20mg 2-AB,則用400μl 30% 的醋酸DMSO溶液配制)
3.以16.7:1(v/w)的比例將2-AB溶液與氰基硼氫化鈉混合配制標(biāo)記反應(yīng)液
4.將所得糖鏈用50μl標(biāo)記反應(yīng)液溶解,65度震蕩反映4-5小時(shí)
5 .將反應(yīng)液按步驟4處理除去過(guò)量的標(biāo)記試劑
 
二、使用MassPrep親水作用樣品處理板除去過(guò)量的標(biāo)記試劑
所需溶液: MiniQ 純水,90% 乙腈 ACN,10 mM 醋酸銨Tris,20% ACN
1.樣品處理板活化,向樣品處理板加入200μl MiniQ純水,再加入 200μl 90% ACN,重復(fù) 90% ACN
2.吸取 50μl 標(biāo)記溶液,加入 450μl ACN( 如有沉淀,請(qǐng)勿離心,以免降低糖鏈回收率),由于板上每孔體積為200μl,可以將樣品分為四份加入
3.將樣品加入處理板,設(shè)定真空度為低(壓力 250-500 mmHg),以保證樣品與HILIC基質(zhì)有充分時(shí)間相互作用;如果溶液在板上沒有移動(dòng),可適當(dāng)增加真空度
4.用 90% ACN清洗處理板兩次
5.換用樣品收集板,用200μl 10 mM 醋酸銨Tris, 20%ACN洗脫,洗脫液轉(zhuǎn)移至1ml 離心管
6.冷凍干燥標(biāo)記后糖鏈溶液凍干后的樣品復(fù)溶于20μl50% ACN中,超聲5 min 后轉(zhuǎn)入U(xiǎn)PLC采樣瓶,進(jìn)樣5μl。
 
參考文獻(xiàn)
(1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column
(2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine
(3) Joomi Ahn,Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC親水相互作用色譜(HILIC)-熒光檢測(cè)法分析2-AB標(biāo)記的多聚糖
 
編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: UPLC 多聚糖 熒光 質(zhì)譜
 

 
 
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