李雪芳，戴絢麗

高效液相色譜法作為食品中防腐劑檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，廣泛地用于各種飲料，食品以及各種原輔料的質(zhì)量控制中[1, 2, 3 ]。但是對(duì)于基質(zhì)較為復(fù)雜的樣品，如醬油、醬包、桂圓肉、乳酸鏈球菌素等，我們以往的預(yù)處理方法是：對(duì)于醬包/濃縮汁，用水稀釋后，加熱超聲萃取，離心去除油層后上過濾，再進(jìn)樣分析。對(duì)于醬油樣品，稀釋過濾后直接進(jìn)樣分析。對(duì)于乳酸鏈球菌素，用水稀釋，超聲，離心過濾后進(jìn)樣分析。該預(yù)處理方法簡(jiǎn)單，但是由于樣品中存在色素，蛋白質(zhì)，脂肪等多種干擾物質(zhì)，上述預(yù)處理方法無法將干擾物質(zhì)去除干凈，使得苯甲酸和山梨酸與存在的多種干擾物質(zhì)在色譜柱很難分離，因此很難獲得滿意的檢測(cè)結(jié)果。同時(shí)，大量的雜質(zhì)對(duì)色譜柱會(huì)造成污染，嚴(yán)重影響色譜柱的性能[4, 5]。為此我們根據(jù)苯甲酸和山梨酸在酸性條件下能同水蒸氣一起蒸餾出來的特點(diǎn)[6]，采用水蒸氣蒸餾法，用BUCHI 自動(dòng)定氮儀對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理，探討了不同蒸餾條件下對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，建立了一種對(duì)復(fù)雜基質(zhì)食品中防腐劑適用的簡(jiǎn)單、快捷的前處理方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分
1.1 試劑與儀器
1.1.1 主要試劑
甲醇，乙腈為色譜純
乙酸銨溶液(0.02mol/L)：稱取1.54g 乙酸銨(優(yōu)級(jí)純)，加水至1000ml，溶解，經(jīng)濾膜(0.45μm)
過濾。
苯甲酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：將1mg/ml 苯甲酸儲(chǔ)備液稀釋1000 倍作為工作液。
山梨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液：將1mg/ml 山梨酸儲(chǔ)備液稀釋1000 倍作為工作液。
1.1.2 主要儀器
Waters 高效液相色譜儀
BUCHI 自動(dòng)蒸餾儀
1.2 色譜條件
色譜柱：Aglient Zorbax Eclipse XDB-C18 4.6x150mm；
流動(dòng)相：乙酸銨溶液:甲醇=90:10 流速：1.0ml/min
檢測(cè)器：二極管陣列檢測(cè)器 進(jìn)樣量：20μL
檢測(cè)波長(zhǎng)： 苯甲酸230nm 山梨酸254nm
1.3 色譜條件
準(zhǔn)確稱取10.00g 均勻樣品，置于蒸餾管內(nèi)，加磷酸1ml，無水硫酸鈉20g，水15ml，在接受瓶中加入320μL1mol/L 氫氧化鈉，加入少量蒸餾水。BUCHI 自動(dòng)蒸餾儀蒸餾強(qiáng)度100%蒸餾5min，收集餾出液，用水定容到200ml，餾份經(jīng)0.45μm 濾膜過濾后進(jìn)樣。
1.4 定量方法
根據(jù)保留時(shí)間定性，外標(biāo)峰面積法定量。

2 結(jié)果與分析
2.1 不同前處理方法檢測(cè)結(jié)果的比較
圖1(a)和1(b)為不同前處理方法對(duì)醬包樣品處理后所得的色譜圖。圖2(a)和1(b)為不同前處理方法對(duì)乳酸鏈球菌素樣品處理后所得的色譜圖。圖1(a)和圖2(a)的預(yù)處理方法為我們以往使用的預(yù)處理方法。圖1(b)和圖2(b)的預(yù)處理方法為本文提出的水蒸氣蒸餾法。從圖中可以看出，用以前的超聲萃取方法檢測(cè)醬包中的苯甲酸時(shí)，由于其基質(zhì)復(fù)雜，干擾成分較多、黏度較高，造成了進(jìn)樣后雜質(zhì)峰過多，色譜峰分離度無法滿足要求，即使用200mm 色譜柱，用梯度洗脫，也無法將防腐劑與污染物質(zhì)完全分離。而采用水蒸氣蒸餾處理后，樣品能完全被凈化，基本無基質(zhì)干擾，因此用150mm 色譜柱，5min 內(nèi)就可將苯甲酸和山梨酸完全分離，因此可以滿足大批量樣品的快速測(cè)定。另一方面，由于蒸餾后上機(jī)測(cè)試的樣品較干凈，因此在實(shí)際的分析測(cè)試中，可以加大進(jìn)樣量，進(jìn)一步降低方法的檢測(cè)限。

2.2 前處理?xiàng)l件的優(yōu)化
2.2.1 蒸餾強(qiáng)度的選擇
蒸餾強(qiáng)度對(duì)苯甲酸和山梨酸的蒸發(fā)程度存在一定影響，本實(shí)驗(yàn)考察了不同蒸餾強(qiáng)度對(duì)苯甲酸和山梨酸回收率的影響，結(jié)果如表1。

隨著蒸餾強(qiáng)度的增大，苯甲酸和山梨酸的蒸出率不斷增大。因此，選擇選擇蒸餾強(qiáng)度100%。

2.2.2 無水硫酸鈉加入量的影響
加入無水硫酸鈉的目的是使樣品溶液的沸點(diǎn)升高，從而使苯甲酸和山梨酸盡可能蒸餾出來。加入不同量的無水硫酸鈉做加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

從上表可以看出，無水硫酸鈉的加入量對(duì)回收率有較大的影響，但當(dāng)無水硫酸鈉的加入量達(dá)到20g 后，苯甲酸和山梨酸的回收率增加不明顯。 因此選擇無水硫酸鈉的加入量為20g。

2.2.3 磷酸加入量對(duì)回收率的影響
山梨酸和苯甲酸可能以山梨酸鹽和苯甲酸鹽的形式存在于樣品中,加入磷酸的目的是使樣品酸化，使防腐劑從鹽的形式完全轉(zhuǎn)化為酸的形式從而能隨水蒸氣蒸餾出來。考察了不同體積的磷酸加入量對(duì)結(jié)果的影響，結(jié)果見表3。

在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，加入磷酸的量增加,山梨酸和苯甲酸的回收率增加,當(dāng)加入磷酸量增加到1ml后，進(jìn)一步增加酸度山梨酸和苯甲酸的回收率增加不明顯。

2.2.4 氫氧化鈉吸收液加入量的選擇
調(diào)節(jié)接受液的pH 值會(huì)影響苯甲酸和山梨酸的在水中的吸收效率。實(shí)驗(yàn)考察了接受瓶中加入不同量1mol/L 氫氧化鈉溶液對(duì)苯甲酸和山梨酸回收率的影響，結(jié)果見表4。

隨著氫氧化鈉加入量的增加，吸收液的PH 升高，苯甲酸和山梨酸的吸收效率增加，當(dāng)氫氧化鈉加入量到320 ul 時(shí)，回收率可達(dá)到要求，因此選擇加入1mol/L 氫氧化鈉320 ul。

2.3 方法的定量限，重現(xiàn)性及回收率考察
取樣品按本方法進(jìn)行預(yù)處理后測(cè)定，以信躁比10，確定了該方法的定量限分別為苯甲酸0.035mg/L；山梨酸0.01mg/L。
對(duì)同一樣品按本方法平行測(cè)定6 次，測(cè)定結(jié)果如表5 所示。

從表中結(jié)果可以看出，采用該方法，苯甲酸和山梨酸測(cè)定的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，這一結(jié)果說明了本方法具有很好的重現(xiàn)性，測(cè)定結(jié)果可靠。
用水蒸氣蒸餾法處理乳酸鏈球菌素，計(jì)算回收率，測(cè)定結(jié)果如表6 所示。


3 結(jié)論
本研究針對(duì)復(fù)雜樣品中防腐劑測(cè)定過程中存在的基質(zhì)嚴(yán)重干擾的問題，采用在酸性條件下水蒸氣蒸餾法進(jìn)行前處理，對(duì)樣品進(jìn)行凈化，建立了高效液相色譜測(cè)定復(fù)雜基質(zhì)樣品中防腐劑的方法。通過實(shí)驗(yàn)確立了最佳的前處理?xiàng)l件以及色譜條件。該方法簡(jiǎn)便、快速，且重現(xiàn)性好，回收率可達(dá)到80%以上，能夠用于日常分析檢測(cè)。