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實驗室凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質(zhì)方法的優(yōu)化

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2011-01-15  來源:互聯(lián)網(wǎng)
核心提示:本文針對目前實驗室凱氏定氮法測定牛奶中蛋白質(zhì)方法進(jìn)行方法的探索優(yōu)化,采用H2O2消化方法可以獲得快速而且準(zhǔn)確的結(jié)果,而直接蒸餾法能更快的獲得結(jié)果。

作者:Michaela Buffler
Buchi實驗室

  歷史上很少有像牛奶這樣的食品與人類密切相關(guān)的。公元5千年前就有家養(yǎng)的奶牛了,而印度奶牛至今被奉為神明。牛奶的味道不僅好,而且它也是健康和營養(yǎng)的食品。實際上,作為最有價值的食品之一,牛奶含有構(gòu)筑肌肉的健康蛋白質(zhì)、強(qiáng)壯骨骼和牙齒的鈣、促進(jìn)消化的乳糖以及強(qiáng)大免疫系統(tǒng)的維他命。牛奶蛋白質(zhì)由于其含有大量的人體必須氨基酸而具有很大的價值,因此它是人體細(xì)胞(如肌肉、器官、皮膚、激素、酶)不可缺少的。
  全世界農(nóng)業(yè)牛奶每年的產(chǎn)量是609百萬噸。最大的牛奶生產(chǎn)地是印度、美國和俄羅斯。歐盟(EU-15)每年生產(chǎn)120百萬噸;因此這也是奶制品的最大的市場。[1][2]
  全世界牛奶的消耗正日新月異的增長著(雖然主要是在奶制品消耗上)。食品企業(yè)用大量的方法處理牛奶,將之轉(zhuǎn)化為不同的產(chǎn)品,從奶酪、糕點(diǎn)以及冰淇淋生產(chǎn)到肉類生產(chǎn)或者膳食處理生產(chǎn)中。[3]
  由于牛奶運(yùn)輸和奶牛育種值的測定對蛋白質(zhì)含量有很大的影響,因此需要對其進(jìn)行定期測定。
  多年以來,測定蛋白質(zhì)的參考方法一直是凱氏定氮法[4]。這個方法是測定樣品中氮的含量,然后乘以特殊因子(牛奶是6.38)來計算出蛋白質(zhì)的含量。
圖1 Kjedahl K-360
                   
然而,牛奶中也含有其它來源的氮(非蛋白氮化合物=NPN),也包括了所有這些氮,并在蛋白質(zhì)含量中顯示出來。為了去除錯誤,在一些國家已經(jīng)從計算總蛋白質(zhì)含量到計算純蛋白質(zhì)含量。

介紹:
牛奶中蛋白質(zhì)含量
牛奶中總蛋白質(zhì)由大約94%的純蛋白質(zhì)(約3.1g/100g)和約6%非蛋白質(zhì)(約0.2g/100g)組成。總蛋白質(zhì)平均含量為3.3%。
總蛋白質(zhì)
總蛋白質(zhì)由蛋白質(zhì)和其它包括在計算中的非蛋白氮化合物(NPN)組成,
純蛋白
純蛋白由酪蛋白和乳蛋白組成。
(純蛋白=總蛋白-NPN)
NPN(非蛋白氮化合物)
NPN主要由尿素和其它氮化合物(如氨基氮、多肽氮、肌氨酸、角蛋白以及銨鹽等)[5]。

方法
  每個實驗室適用不同的標(biāo)準(zhǔn)用于他們的方法測定(使用傳統(tǒng)的官方建立方法如§35 LMBG, § 64LFGB, AOAC,ISO, EPA和DIN,或者其它官方?jīng)]有要求的但是可節(jié)約化學(xué)試劑、快速處理時間和保護(hù)環(huán)境的方法),這就是為什么采用從原有方法衍生出來修改過的方法的原因。
圖2 H2O2 抽吸模塊
                     
  用H2O2 消解的凱氏過程· 用H2O2 消解法特別適用于高泡沫樣品。然而為了能夠執(zhí)行此方法,需要一個特殊的抽吸模塊(圖2)來滴加H2O2。該抽吸模塊的漏斗是裝有玻璃沙芯,便于H2O2 的勻速流動。
  H2O2 消化的好處:
·節(jié)約50%的消化時間
·消化過程無泡沫
·無重金屬污染,保護(hù)環(huán)境
·用69%的硫酸替代98%的濃硫酸過程:在樣品管中加入5g 牛奶樣品,然后加入10mL H2O2(30%)和30mL 的硫酸(69%)。把H2O2 抽吸模塊放置到
架子上。10min 消化后,再加入20mLH2O2。

微量凱式法
  微量方法與官方方法處理方式一樣。然而,與官方方法相比,這種方法需要更小體積的樣品(1.8mL),更少的化學(xué)試劑量,消化時間也會顯著減少。
  凱氏方法過程(官方方法)
  過程:
  根據(jù)凱氏方法測定蛋白質(zhì)時,牛奶樣品用濃硫酸處理,生成硫酸銨鹽。硫酸銨鹽通過與堿NaOH反應(yīng),生成氨氣,通過水蒸汽蒸餾被導(dǎo)入到硼酸吸收液中。然后用HCl或H2SO4滴定溶液滴定。
  NPN測定
  NPN測定的第一步就是用三氯乙酸將蛋白質(zhì)沉淀。然后根據(jù)凱氏定氮法分析濾液。
  牛奶直接蒸餾法
  直接蒸餾法是一個簡單快速的測定蛋白質(zhì)的方法,其省略了消化這一步。
  過程:
  取10mL牛奶樣品于樣品管中。開始蒸餾之前,加入20mL氯化鋇(10%)到樣品中,然后采用與官方方法相同的過程。
牛奶樣品在堿性溶液中加熱,然后釋放出氨氣。由于蛋白質(zhì)的組成部分谷氨酸和丙氨酸的快速水解生成大部分的氨氣。該反應(yīng)過程只需幾分鐘即可完成。另外,少量的氨氣是由其它氨基酸完全分解而生成,但是這種分解速度很慢,不會影響該過程。該方法需要測定一個系數(shù)(轉(zhuǎn)換系數(shù))以簡單地測定個氮和蛋白質(zhì)含量。使用直接蒸餾方法,可以在10min內(nèi)就可測定蛋白質(zhì)含量。

表1 配置

上述儀器用于該文章中描述的應(yīng)用中,也可以使用其它來自Buchi 公司的蒸餾和消解儀。

表2 消化參數(shù)


表3 蒸餾參數(shù)

表4 滴定參數(shù)

為了測定低濃度氮含量樣品(<10mg N),為了能夠更好的檢測轉(zhuǎn)折點(diǎn),推薦使用低濃度的硼酸溶液(如2%,參見微量方法)。選擇適當(dāng)?shù)臉悠焚|(zhì)量/體積和滴定溶液的濃度,滴定溶液的消耗大約是5~20mL。

表5 結(jié)果

牛奶包裝盒上的標(biāo)示以g/mL為單位,這個標(biāo)示值不能直接與獲得的結(jié)果(g/g=%)做比較。因此雖然這個記過可以用于比較,但是不同的方法也可以與官方方法做比較。

結(jié)論
從上表可看出,優(yōu)化的方法可獲得重復(fù)性好的結(jié)果。這就意味著這些方法可作為大有益處的替代方法以進(jìn)行實驗室常規(guī)過程。
所有文章中提到的方法能夠得到良好的結(jié)果。因此實驗室可以選擇適合自己要求的方法,如微量凱氏方法可以盡可能的減少化學(xué)物的使用,H2O2消化方法是為了獲得快速而且準(zhǔn)確的結(jié)果,或者直接蒸餾法是為了盡快的獲得結(jié)果。然而,當(dāng)需要強(qiáng)制使用官方方法(如AOAC,DIN),是不能夠使用優(yōu)化方法的。

 

編輯:songjiajie2010

 
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