1、樣品的稀釋

2、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

3、結(jié)果與報(bào)告

二、具體過(guò)程

1、樣品的稀釋

（1）固體和半固體樣品

稱取25g置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內(nèi)，8000r/min～10000r/min均質(zhì)1min～2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min～2min，制成1：10的樣品勻液。

（2）液體樣品

以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶（瓶?jī)?nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無(wú)菌玻璃珠）中，充分混勻，制成1：10的樣品勻液。

上步完成后，用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1：10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無(wú)菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復(fù)吹打使其混合均勻，制成1：100的樣品勻液。

根據(jù)對(duì)樣品污染狀況的估計(jì)，選擇1個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內(nèi)，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內(nèi)作空白對(duì)照。

之后，及時(shí)將15mL～20mL冷卻至48℃的平板計(jì)數(shù)瓊脂培養(yǎng)基（可放置于48℃±2℃恒溫水浴箱中保溫）傾注平皿，并轉(zhuǎn)動(dòng)平皿使其混合均勻。

2、注意事項(xiàng)

移液過(guò)程使用的器具，都應(yīng)避免微生物污染。使用耐高壓移液槍，核查洗耳球無(wú)菌程度，避免移液槍觸及均質(zhì)袋或試管內(nèi)壁……

樣品勻液完成后，可按相同操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。

3、培養(yǎng)和計(jì)數(shù)

樣品稀釋完成后，就要進(jìn)行培養(yǎng)和菌落計(jì)數(shù)了。

待瓊脂凝固后，將平板翻轉(zhuǎn)，36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h。

如果樣品中可能含有在瓊脂培養(yǎng)基表面彌漫生長(zhǎng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養(yǎng)基（約4mL），凝固后翻轉(zhuǎn)平板，按相同條件進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)完成后，就要進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)了，計(jì)數(shù)可用肉眼觀察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計(jì)數(shù)器，記錄稀釋倍數(shù)和相應(yīng)的菌落數(shù)量。菌落計(jì)數(shù)以菌落形成單位（colony-forming units，CFU）表示。

選取菌落數(shù)在30CFU～300CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(zhǎng)的平板計(jì)數(shù)菌落總數(shù)。低于30CFU的平板記錄具體菌落數(shù)，大于300CFU的可記錄為多不可計(jì)。每個(gè)稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)采用兩個(gè)平板的平均數(shù)。

（1）大片菌落

其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(zhǎng)時(shí)，則不宜采用，而應(yīng)以無(wú)片狀菌落生長(zhǎng)的平板作為該稀釋度的菌落數(shù)；若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計(jì)算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數(shù)。

（2）鏈狀生長(zhǎng)

當(dāng)平板上出現(xiàn)菌落間無(wú)明顯界線的鏈狀生長(zhǎng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計(jì)數(shù)。

（3）結(jié)果與報(bào)告

為了生成結(jié)果和報(bào)告，需要根據(jù)計(jì)數(shù)結(jié)果和公式計(jì)算出菌落總數(shù)。需要注意的是，對(duì)于菌落數(shù)量不同的培養(yǎng)皿，計(jì)數(shù)原則有所不同。

若所有平板上為蔓延菌落而無(wú)法計(jì)數(shù)，則報(bào)告菌落蔓延。若空白對(duì)照上有菌落生長(zhǎng)，則此次檢測(cè)結(jié)果無(wú)效。

稱重取樣以CFU/g為單位報(bào)告，體積取樣以CFU/mL為單位報(bào)告。