慢病毒包裝技術(shù)專題

Q:什么是慢病毒 ?

A: 慢病毒載體 (Lenti vector)是用于感染細(xì)胞以實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定導(dǎo)入基因或siRNA的病毒載體系統(tǒng)，其感染效率可以達(dá)到100%。慢病毒和細(xì)胞結(jié)合后通過包裝蛋白將含有目的基因或者干擾序列釋放到細(xì)胞內(nèi)。慢病毒RNA通過逆轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄為DNA。DNA整合前復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核并整合到靶細(xì)胞的染色體DNA。由于靶基因或基因干擾序列整合到染色體上并且伴隨著細(xì)胞分裂時(shí)DNA的復(fù)制一起復(fù)制，基因的導(dǎo)入能夠獲得穩(wěn)定的表達(dá)。慢病毒的顯著優(yōu)勢在于其可以整合到非分裂細(xì)胞，而其他載體(如非病毒載體、腺病毒載體、腺相關(guān)病毒載體)不具備整合到靶細(xì)胞染色體的特性，或者只能整合到分裂細(xì)胞的染色體(如常規(guī)的逆轉(zhuǎn)錄病毒)。目前我們使用的慢病毒載體是基于HIV-1改造而來，該載體使用最為廣泛，經(jīng)過科學(xué)家的多次改造在包裝滴度和使用安全性等方面都非常理想。在實(shí)際的使用中我們可以用來表達(dá)目的基因或目的基因加上報(bào)告基因，近年來隨著RNAi研究的深入，越來越多的科學(xué)家用慢病毒載體來表達(dá)干擾序列.

Q:慢病毒用于rna i研究

A:目前慢病毒也被廣泛地應(yīng)用于表達(dá)RNAi的研究中。由于有些類型細(xì)胞脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染效果差，轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)的siRNA半衰期短，體外合成siRNA對基因表達(dá)的抑制作用通常是短暫的，因而使其應(yīng)用受到較大的限制。采用事先在體外構(gòu)建能夠表達(dá)siRNA的載體, 然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄siRNA的策略，不但使脂質(zhì)體有效轉(zhuǎn)染的細(xì)胞種類增加，而且對基因表達(dá)抑制效果也不遜色于體外合成siRNA，在長期穩(wěn)定表達(dá)載體的細(xì)胞中，甚至可以發(fā)揮長期阻斷基因表達(dá)的作用。在所構(gòu)建的siRNA表達(dá)載體中，是由RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子來指導(dǎo)RNA合成的，這是因?yàn)镽NA聚合酶Ⅲ有明確的起始和終止序列，而且合成的RNA不會(huì)帶poly A尾。當(dāng)RNA聚合酶Ⅲ遇到連續(xù)4個(gè)或5個(gè)T時(shí)，它指導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄就會(huì)停止，在轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物3’端形成1~4個(gè)U。U6和H1 RNA啟動(dòng)子是兩種RNA聚合酶Ⅲ依賴的啟動(dòng)子，其特點(diǎn)是啟動(dòng)子自身元素均位于轉(zhuǎn)錄區(qū)的上游，適合于表達(dá)～21ntRNA和～50ntRNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)(stem loop)。在siRNA表達(dá)載體中，構(gòu)成siRNA的正義與反義鏈，可由各自的啟動(dòng)子分別轉(zhuǎn)錄,然后兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合形成siRNA;也可由載體直接表達(dá)小發(fā)卡狀RNA(small hairpin RNA, shRNA), 載體包含位于RNA聚合酶Ⅲ啟動(dòng)子和4～5T轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)之間的莖環(huán)結(jié)構(gòu)序列，轉(zhuǎn)錄后即可折疊成具有1~4 個(gè)U 3 ’ 突出端的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)一步加工成siRNA。構(gòu)建載體前通常要通過合成siRNA的方法，尋找高效的siRNA，然后從中挑選符合載體要求的序列，將其引入siRNA表達(dá)載體。

Q:如何生產(chǎn)病毒?

A:載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后收獲病毒上清，通過超濾和超速離心進(jìn)行純化和濃縮獲得高滴度和高純度的慢病毒顆粒。

Q:病毒是否可以重新凍融?

A:病毒可以凍融，但是反復(fù)多次的凍融會(huì)降低病毒的滴度。

Q:什么是病毒的滴度?

A:病毒的滴度即每升溶液中含有的病毒數(shù)量。滴度值用于評估轉(zhuǎn)導(dǎo)一定數(shù)量靶細(xì)胞所需要的病毒數(shù)量。

Q:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)的含義?

A:轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)即能夠感染并整合到細(xì)胞內(nèi)的病毒載體基因組,

Q:MOI的含義?

A:MOI指用來轉(zhuǎn)染單個(gè)細(xì)胞的病毒數(shù)量，即含義是感染時(shí)病毒與細(xì)胞數(shù)量的比值。如果MOI為1則感染每個(gè)細(xì)胞的病毒顆粒數(shù)為1。同一種類同一批次的病毒感染不同種類的細(xì)胞，其MOI值不盡相同，需要進(jìn)行梯度實(shí)驗(yàn)測算;另外不同的滴度檢測方法也會(huì)導(dǎo)致MOI很大的差異。

Q:可以獲得的病毒可以達(dá)到多少滴度?

A:常規(guī)生產(chǎn)的病毒的滴度在2 x 10E8TU/ml之間。

Q:如何使用慢病毒感染細(xì)胞?

A:使用慢病毒感染細(xì)胞的操作流程取決于細(xì)胞種類，因此首先要了解細(xì)胞的來源和背景，我們將在發(fā)貨時(shí)將通用操作流程發(fā)送客戶。通常來講首先要根據(jù)準(zhǔn)確的MOI和需要感染的細(xì)胞量計(jì)算所需要的病毒量，然后將所需病毒也加入培養(yǎng)體系后4小時(shí)左右即可換成完全培養(yǎng)基正常培養(yǎng)。

Q:如何確定慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率?

A:慢病毒感染靶細(xì)胞的感染效率可以通過Real-time PCR檢測靶細(xì)胞中的慢病毒載體拷貝數(shù)來測算。另外如果構(gòu)建的慢病毒載體帶有標(biāo)記基因(如GFP、RFP等)，則可以通過FACS檢測陽性細(xì)胞的比例來評估感染效率。

Q:慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因的表達(dá)是瞬時(shí)表達(dá)還是穩(wěn)定表達(dá)?

A:慢病毒感染靶細(xì)胞后，目的基因或者干擾序列被整合到細(xì)胞的染色體DNA;并且隨靶細(xì)胞的增殖分化，目的基因或者干擾序列也隨靶基因DNA的一起復(fù)制并遺傳到子代細(xì)胞中,所以是穩(wěn)定表達(dá)。

Q:通常生產(chǎn)一個(gè)慢病毒載體的實(shí)驗(yàn)周期是多久?

A:我們將在收到您的訂單和實(shí)驗(yàn)材料20個(gè)工作日左右完成病毒的生產(chǎn)和檢測，如果客戶需要委托購買或者合成目的基因(干擾序列)，會(huì)增加相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)周期。

Q:是否可以直接從慢病毒顆粒中提取慢病毒載體?

A:不可以。慢病毒載體用于轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞后生產(chǎn)病毒，包裝好的病毒顆粒只含有載體中5' and 3' LTR's的RNA。

Q:使用公司提供的病毒可以感染多少細(xì)胞?

A:可以感染的細(xì)胞量取決于您需要感染的靶細(xì)胞的易感性，原代細(xì)胞或者難感染的細(xì)胞需要較高的MOI,因此需要的病毒量也比較多。我們建議您可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定目的細(xì)胞的MOI,即使用公司的GFP病毒設(shè)定不同的MOI(1、5、10、15等)分別感染目的細(xì)胞。

Q:如何知道靶細(xì)胞是否能夠被慢病毒感染?

A:根據(jù)現(xiàn)有的研究表明，慢病毒感染譜很廣，包括分裂和非分裂細(xì)胞。一方面可以通過查詢文獻(xiàn)得知是否可以被感染，另外也可以使用提供的GFP慢病毒載體對照顆粒進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，確定細(xì)胞的易感性和MOI.

Q:在使用慢病毒時(shí)需要哪些預(yù)防措施?

A:慢病毒的操作要求在BSL2級別的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)操作人員需帶上乳膠手套，按照標(biāo)準(zhǔn)的細(xì)胞培養(yǎng)操作流程進(jìn)行。

Q:在實(shí)驗(yàn)室使用慢病毒是否安全?

A:慢病毒載體包括包裝成分和載體成分：包裝成分由HIV-1基因組去除了包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的順式作用序列而構(gòu)建，能夠反式提供產(chǎn)生病毒顆粒所必需的蛋白;載體成分則與包裝成分互補(bǔ)，即含有包裝、逆轉(zhuǎn)錄和整合所需的HIV順式作用序列，同時(shí)具有異源啟動(dòng)子控制下的多克隆位點(diǎn)及在此位點(diǎn)插入的目的基因。為降低兩種成分同源重組恢復(fù)成野生型病毒的可能，需盡量減少二者的同源性，如將包裝成分上5′LTR換成CMV (巨細(xì)胞病毒早期啟動(dòng)子)、3′LTR換成SV40 polyA等。包裝成分通常被分開構(gòu)建到兩個(gè)質(zhì)粒上，一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Gag和Pol蛋白，另一個(gè)質(zhì)粒表達(dá)Env蛋白，其目的也是降低恢復(fù)成野生型病毒的可能。目前在用HIV-1載體已經(jīng)進(jìn)行的所有體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中，未出現(xiàn)過有復(fù)制力的HIV，說明其安全性是有保證的。

Q:什么是自身失活慢病毒載體(SIN )?

A:SIN 載體的構(gòu)建是將載體3′LTR(長末端重復(fù)序列) 中的U3區(qū)增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列刪除。U3-LTR 是前病毒DNA 兩端LTR 中U3 的模板, 在逆轉(zhuǎn)錄過程中, 3′L TR 中的缺失被傳遞到子代載體的5′L TR 中, 所形成的載體缺乏HIV-1 的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子序列, 即使在所有病毒蛋白都存在的情況下也不能轉(zhuǎn)錄RNA , 產(chǎn)生了一個(gè)滅活的前病毒, 但其中的外源啟動(dòng)子仍然有活性, 能進(jìn)行基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)。這種方式主要用來消除病毒LTR 中的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子序列對病毒載體中外源啟動(dòng)子指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的干擾作用，以及消除可能的由3′L TR 啟動(dòng)子指導(dǎo)的下游基因組中原癌基因的激活與轉(zhuǎn)錄作用, 一定程度上提高了載體的安全性

Q:獲得慢病毒顆粒后是否可以在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)一步增殖?

A:不可以�？茖W(xué)家考慮到了其使用的生物安全性將慢病毒載體改造成為復(fù)制缺陷型病毒載體。獲得的病毒顆粒的基因組不具有重組所需要的基因，并且載體具有3'LTR.自身失活的特性。

Q:慢病毒顆粒能保存多長時(shí)間?

A:在-80度條件下，慢病毒可以保存6個(gè)月左右而滴度沒有顯著丟失。

Q:公司生產(chǎn)的慢病毒的滴度是怎么定義的?

A:公司生產(chǎn)的慢病毒的滴度是感染293T細(xì)胞后使用FACS檢測有限稀釋的病毒感染細(xì)胞的陽性細(xì)胞比例來測算，或者使用Real-time PCR的方法檢測獲得的。