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免疫組化SABC法操作流程

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2013-08-02  來源:實(shí)驗(yàn)室資訊網(wǎng)
核心提示:1、洗載玻片將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時(shí)使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面
 1、洗載玻片


將載玻片置于重鉻酸鉀和濃H2SO4混合液中,目的是為了是載玻片上的硅膠等除去,同時(shí)使一些肉眼看不見的凹凸不平的表面變平整,便于組織吸附,然后置于清水中清洗,除去殘余的重鉻酸鉀和濃H2SO4(大約沖一個(gè)小時(shí)左右),再將載玻片浸泡于酒精之中, 然后放到架子上,置于37 oC溫箱中,將多聚賴氨酸涂布于玻片的表面,由于Lys帶正電,而大多數(shù)的組織帶負(fù)電荷,從而產(chǎn)生吸附作用。

2、包埋組織

先在鐵模具中加入一些液態(tài)石蠟,先稍微冷卻,然后再將待包埋的組織置于石蠟之中,并排列整齊,再將塑料模具盒蓋上,最后加入少許液體石蠟,進(jìn)行冷凍,使石蠟變成固態(tài)。

3、切片

將包埋好的組織從模具上取下來,并置于石蠟切片機(jī)上,切片機(jī)通過調(diào)節(jié)上下左右來來使組織和切割方向一致,然后調(diào)節(jié)切片的厚度,一般為5 um,如果比較難切,則可以適當(dāng)調(diào)整厚度,用毛筆將切割的載玻片向外拉,并用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置于40 oC溫水中。

4、撈組織

當(dāng)組織載玻片置于40 oC溫水中之前,要先將水浴中的氣泡趕走,以免氣泡受熱上浮而貼到組織上,組織受熱展開,最好是組織不起皺紋,用載玻片撈組織時(shí),一般取載玻片的下1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張,其中2-3張是備用的,每張載玻片上通常撈兩份組織,做對(duì)照使用,這樣形成的誤差就比較小了,而且撈載玻片的時(shí)候最好方向一致,以便觀察,再將撈出來的載玻片置于架子上,放入37 oC溫箱中烘干。

5、脫蠟

依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精,起脫蠟作用的主要是二甲苯,依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10 min,天氣熱可以少放幾分鐘,相反,天氣較冷的話就要適當(dāng)延長脫蠟時(shí)間,一般為12-15 min。

6、抗原修復(fù)

脫蠟后在清水中沖洗一段時(shí)間,加入3%H2O2浸泡10 min,從而除去內(nèi)源性的過氧化氫酶,然后倒掉H2O2,在清水中洗兩次,再加入檸檬酸緩沖液,放入微波爐中蒸煮3 min(中火),一般剛到沸騰即可,冷卻至室溫,然后再蒸煮一次,冷卻至室溫,蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來。

7、血清封閉

冷卻至室溫后,將檸檬酸緩沖液倒掉,水洗2次,并將載玻片置于PBS中5 min,洗2次,擦干組織周圍的PBS液,馬上加上血清,使一些非特異性的位點(diǎn)封閉起來,然后放入37 oC溫箱中半小時(shí)。血清稀釋10倍(900 ul PBS:100 ul血清封閉液)。

8、加一抗

將溫箱中的載玻片取出,用吸水紙擦干載玻片反面和正面組織周圍的血清,加一抗,如果做對(duì)照實(shí)驗(yàn),就在對(duì)照的組織上加PBS。加完一抗后于4oC冰箱中保存過夜。

9、加二抗

將載玻片從冰箱中取出,放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上二抗,然后置于37oC溫箱中半小時(shí)。

10、加SABC

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上SABC, 然后置于37oC 溫箱中半小時(shí)。SABC稀釋100倍(990ul PBS:10ul SABC)。

11、加顯色劑

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次,每次5min,擦干組織周圍的PBS后加上顯色劑。(顯色劑的配置:在1ml水中加1滴顯色劑A,搖勻,然后加1滴顯色劑B,搖勻,再加1滴顯色劑C,搖勻)   A:DAB   B:H2O2   C:磷酸緩沖液

12、復(fù)染

將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后,浸泡于蘇木精中染色,一般動(dòng)物組織為半分鐘,植物組織3-5min。

13、脫水

將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后,依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min,最后浸泡在二甲苯中,搬到通風(fēng)柜中。

14、封片

用中性樹膠滴在組織旁邊,再用蓋玻片蓋上,要先放平一側(cè),然后輕輕放下另一側(cè),以免產(chǎn)生氣泡,封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

編輯:songjiajie2010

 
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關(guān)鍵詞: 免疫組化 SABC法 抗原修復(fù)
 

 
 
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