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檢測(cè)方法：
2. 所需材料
●ModulusTM單管型多功能檢測(cè)儀（貨號(hào)：9200-000或9200-002）
●紫外熒光模塊（貨號(hào)：9200-041）
●微量比色杯（貨號(hào)：7000-950）和微量適配器（貨號(hào)：9200-928）或比色杯（貨號(hào)：7000-959）
●Hoechst 33258 10 mg/ml (分子探針 H3569)
●10XTNE儲(chǔ)存緩沖液
●0.45μm的過(guò)濾水
3. 考慮因素
3.1 DNA樣品中的AT含量會(huì)影響到Hoechst 33258-DNA熒光，因此，檢測(cè)樣品時(shí)設(shè)一對(duì)照是非常重要的，小牛胸腺DNA由于是雙鏈、高度聚合并含有大約58%的AT（42% GC）而經(jīng)常被用作動(dòng)植物DNA的對(duì)照。對(duì)于細(xì)菌DNA來(lái)說(shuō)，它會(huì)有不同的對(duì)照，因?yàn)椴煌N的AT含量變化較大。
3.2 不同構(gòu)造的質(zhì)粒DNA（超螺旋型、螺旋型、環(huán)形和、線型）會(huì)有不同的Hoechst 33258結(jié)合效果。因此，選擇一種與樣品特征相似的標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照也是很重要的。
3.3 在單鏈基因組DNA上的Hoechst 33258熒光只有在雙鏈基因組DNA上的一半，單鏈DAN片段的熒光量并不會(huì)與單鏈DAN的濃度成比例地引發(fā)熒光。
3.4 用于全細(xì)胞DNA抽提的緩沖液對(duì)后期的檢測(cè)沒(méi)有什么影響。
3.5 少量的去污劑（＜0.01% SDS）對(duì)檢測(cè)也沒(méi)有什么影響。
3.6 含鹽濃度為3M NaCl的DNA抽提樣對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響。為獲得較強(qiáng)的熒光，純化的DNA樣品中至少要含有200mM的NaCl，未純化樣品中需含2.0-3.0M的NaCl。對(duì)于未純化樣品來(lái)講，較高的鹽濃度會(huì)將結(jié)合在DNA上的蛋白裂解下來(lái)，便于染料分子的結(jié)合。
3.7 RNA對(duì)檢測(cè)沒(méi)有影響，因?yàn)镠oechst 33258通常并不與RNA結(jié)合。來(lái)之于RNA的熒光信號(hào)通常會(huì)低于相同DNA濃度的1%。
4.試劑制備
4.1 Hoechst 33258儲(chǔ)存液
1 mg/ml Hoechst 33258：1ml的Hoechst 33258（10 mg/ml）加9ml的用0.45μm濾膜過(guò)濾的蒸餾水稀釋而成。
注：Hoechst 33258可能會(huì)致癌和導(dǎo)致基因突變，操作時(shí)須帶手套、面罩，并且在通風(fēng)櫥內(nèi)操作。
4.2 10XTNE儲(chǔ)存緩沖液
溶解于800ml蒸餾水中：12.11g Tris堿[Tris（羥甲基）氨基甲烷]，分子量=121.14；3.72g EDTA乙二胺四乙酸，二鈉鹽，二水合物，分子量=372.20；116.89g 氯化鈉，分子量=58.44。用濃鹽酸調(diào)節(jié)溶液PH至7.4，補(bǔ)加蒸餾水定容至1000ml，使用前用0.45μm濾膜過(guò)濾，4℃可保存3個(gè)月。
注：PH和氯化鈉濃度對(duì)于Hoechst試劑和DNA的結(jié)合至關(guān)重要。
1倍的TNE:用90ml蒸餾水（0.45μm濾膜過(guò)濾）稀釋10ml 10倍的TNE。
4.3 準(zhǔn)配2倍的染料液用于10-1000 ng/ml的DNA：用100ml的1倍的TNE稀釋20µl Hoechst 33258 儲(chǔ)存液 (1 mg/ml)，室溫放置，現(xiàn)用現(xiàn)配，一旦染料加入千萬(wàn)別再過(guò)濾！
4.4 小牛胸腺DNA標(biāo)準(zhǔn)液：準(zhǔn)備溶解在1倍TE濃度為1 mg/ml的小牛胸腺DNA儲(chǔ)存液，輕擊小管充分混勻，4℃可保存3個(gè)月。
5. 樣品檢測(cè)
5.1熒光模塊的安裝
5.1.1關(guān)掉多功能機(jī)電源開(kāi)關(guān)，根據(jù)操作手冊(cè)插入紫外熒光模塊
5.1.2打開(kāi)電源開(kāi)關(guān)，校準(zhǔn)前先預(yù)熱1min。
5.1.3用于10X10mm比色杯的實(shí)驗(yàn)方案
5.1.3.1準(zhǔn)備1ml 2000 ng/ml dsDNA標(biāo)準(zhǔn)液校準(zhǔn)比色杯。
5.1.3.2以1:1的比例加2倍的染料工作液到2000 ng/ml dsDNA標(biāo)準(zhǔn)液中，終濃度為1000 ng/ml。
5.1.3.3在另外的小管中加入空白對(duì)照液：2倍的染料工作液以1:1的比例加入1X TNE緩沖液，最少2ml。
5.1.3.4校準(zhǔn)多功能機(jī)用1000 ng/ml。
注：用一個(gè)和檢測(cè)樣品濃度相同或相近的標(biāo)準(zhǔn)樣優(yōu)化系統(tǒng)，使檢測(cè)更精確。例如，若檢測(cè)樣品濃度在300 ng/ml，要用一個(gè)500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)DNA樣。標(biāo)準(zhǔn)樣濃度應(yīng)該是與檢測(cè)樣濃度相同或超出100 ng/ml。
5.1.3.5保存這次校準(zhǔn)以供將來(lái)使用（可選）
5.1.3.6向1ml樣品的小管中加1ml 2倍的染料液，需要的話，可以用1倍TNE稀釋樣品。
注：小管中溶液體積最少需2ml。
5.1.3.7放入多功能機(jī)讀數(shù)前平衡樣品和染料混合液5min。
5.1.3.8樣品和染料濃度會(huì)在多功能機(jī)顯示屏上顯示。
注：由于染料的加入，最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。
5.1.4使用微量比色杯的實(shí)驗(yàn)方案
5.1.4.1標(biāo)準(zhǔn)液制備。將1mg/ml 的DNA儲(chǔ)存液用1倍TNE稀釋到2μg/ml，加相等體積的2倍的染料工作液，而后重復(fù)步驟4.4，充分混合。
注：用一個(gè)和檢測(cè)樣品濃度相同或相近的標(biāo)準(zhǔn)樣優(yōu)化系統(tǒng)，使檢測(cè)更精確。例如，若檢測(cè)樣品濃度在300 ng/ml，要用一個(gè)500 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)DNA樣。標(biāo)準(zhǔn)樣濃度應(yīng)該是與檢測(cè)樣濃度相同或超出100 ng/ml。
5.1.4.2空白對(duì)照液制備。在另一只小離心管中加入相同體積的樣品緩沖液（通常是1倍TNE）和2倍的染料工作液。
5.1.4.3混合小離心管中加有2倍染料工作液的樣品。
注：在微量比色杯中不要混合檢測(cè)樣、標(biāo)準(zhǔn)樣或有染料液的空白對(duì)照液。
5.1.4.4取100μl檢測(cè)樣、標(biāo)準(zhǔn)樣和空白對(duì)照液分別加到微量比色杯中，室溫避光靜置2-5min。
注：不要在微量比色杯中引入氣泡，它會(huì)導(dǎo)致讀數(shù)錯(cuò)誤。
5.1.4.5校準(zhǔn)多功能機(jī)用1000 ng/ml。
5.1.4.6保存這次校準(zhǔn)以供將來(lái)使用（可選）
5.1.4.7微量比色杯中樣品所測(cè)濃度會(huì)在多功能機(jī)顯示屏上顯示。
注：由于染料的加入，最終濃度要小于起始濃度的1/2。另外也要考慮到起始樣品的稀釋。
