緩沖液的選擇

當(dāng)分離酸性或堿性樣品時(shí)，通常需加入一定量的緩沖鹽，緩沖鹽的濃度及類型如何確定？

1、緩沖鹽的濃度

緩沖鹽的濃度對(duì)離子樣品保留值的影響通常較小，濃度一般為10-50mmol/l。

2、緩沖鹽的類型

緩沖鹽類型的選擇，主要取決于所需要的緩沖能力，在反向色譜中，流動(dòng)相中水相的pH和離子強(qiáng)度在開發(fā)對(duì)條件微小變化不敏感的耐用方法中非常重要。對(duì)于離子型化合物，典型的樣品的保留隨pH改變而明顯變化。通常在pH2到4條件下，保留時(shí)間對(duì)pH的微小改變穩(wěn)定性最高。因此建議將這一pH范圍作為大多數(shù)樣品方法開發(fā)的起始pH，包括堿性化合物和一般的弱酸。緩沖鹽溶液的pH值越接近其pka，緩沖能力越強(qiáng)。一般緩沖鹽溶液的pH值應(yīng)在其pka±1的范圍內(nèi)。

3、緩沖鹽的離子締合（反離子對(duì)液相色譜行為的影響與理論解析）

如酸性條件下分離堿性化合物，加入NH4CL，堿性物質(zhì)離子與反離子相互作用的平衡導(dǎo)致它們相互的溶劑化并形成相關(guān)復(fù)合物離子：

[堿]+[Cl]− = [堿+ -- Cl−]，在低pH時(shí)，堿性化合物被完成質(zhì)子化，溶液陰離子（如CL-）在流動(dòng)相中破壞了堿性物周圍的水分子并增加其疏水性，導(dǎo)致樣品保留時(shí)間增加，當(dāng)鹽濃度大于50mM時(shí)，保留時(shí)間略有下降[4]，這可能是飽和反離子CI-引起的離子相互作用的屏蔽作用。此外還可以添加硫酸鈉或者高氯酸鈉等改變堿性化合物的保留。

4.緩沖鹽的其它性質(zhì)

緩沖鹽的溶解性、揮發(fā)性和穩(wěn)定性（可能與設(shè)備、樣品和或色譜柱發(fā)生作用）對(duì)某些分離也很重要。如磷酸鹽，在含有高濃度有機(jī)相（70%以上），可能會(huì)析出；一些緩沖劑放置即降解，貯存或長(zhǎng)期使用后其紫外吸收會(huì)增加（如：TFA、三乙胺）；一些緩沖鹽能通過形成離子對(duì)，對(duì)樣品發(fā)生作用（如三氟醋酸緩沖劑與陽(yáng)離子樣品，三乙胺與陰離子樣品等）；揮發(fā)性的緩沖鹽如碳酸胺、甲酸銨、醋酸銨等可應(yīng)用于蒸發(fā)光散射、質(zhì)譜的檢測(cè)。

5.pH的選擇

通常進(jìn)行分析方法開發(fā)時(shí)要求遠(yuǎn)離化合物的pKa，是遠(yuǎn)離主成分的pKa還是遠(yuǎn)離待測(cè)雜質(zhì)的pKa？如果在pKa附件是否方法就不能用？

是各雜質(zhì)的pKa，只不過平時(shí)經(jīng)常是通過主成分的pKa來(lái)代表各雜質(zhì)，制定遠(yuǎn)離pKa±2。pKa為化合物的酸堿平衡常數(shù)，即在該pH條件下，該化合物處于分子離子狀態(tài)，分子狀態(tài)化合物，疏水性較強(qiáng)，即色譜柱保留時(shí)間較長(zhǎng)；離子狀態(tài)化合物親水性較強(qiáng)，及色譜柱保留時(shí)間較短。制定的流動(dòng)相pH在待測(cè)組分pKa±2以內(nèi)，有時(shí)也是可用的，只不過可能存在各雜質(zhì)的色譜行為對(duì)pH較敏感，尤其是保留時(shí)間。會(huì)不會(huì)出現(xiàn)裂縫或出現(xiàn)雙峰的現(xiàn)象，個(gè)人認(rèn)為通常不會(huì)，因?yàn)榉肿与x子間也存在相互作用力，除非分子疏水作用、離子的親水作用大于分子離子間的作用力，才有可能裂縫/出雙峰。

6.通常開發(fā)方法建議在低pH進(jìn)行

大多數(shù)反相柱都可以在pH2-8條件下使用，強(qiáng)酸條件下硅膠基質(zhì)發(fā)生水解，造成塌陷。高pH 條件下硅膠會(huì)溶解，當(dāng)然硅膠柱經(jīng)特殊處理，如硅甲基嵌入、增加亞乙基橋等可以增強(qiáng)填料的耐酸堿性。對(duì)于一般酸堿化合物的分離，建議先從酸性條件起步，無(wú)法達(dá)到目的后再向中性、堿性條件進(jìn)行嘗試（應(yīng)注意色譜柱的耐受性）。

7.調(diào)節(jié)pH的應(yīng)用及注意事項(xiàng)

1、當(dāng)pH改變時(shí)，有些酸性或堿性樣品的吸光度會(huì)發(fā)生改變（因?yàn)樽贤馕�收�?huì)有溶劑效應(yīng)，紅移或藍(lán)移），故在不同pH值時(shí)運(yùn)行的已知化合物無(wú)法保持其峰大小不變。分析方法開發(fā)時(shí)，通常采用“混標(biāo)”進(jìn)行分離度摸索，無(wú)法采用峰高進(jìn)行標(biāo)識(shí)時(shí)，檢測(cè)采用全波長(zhǎng)進(jìn)行峰的定位（采用光電二極管陣列檢測(cè)器）。

2、pH變化可導(dǎo)致離子化合物的k值發(fā)生10倍或更大的變化，根據(jù)需要對(duì)流動(dòng)項(xiàng)（B%）進(jìn)行調(diào)整。

3、在分離一組酸堿官能團(tuán)相似的化合物時(shí)，通過改變pH來(lái)優(yōu)化分離度是個(gè)不錯(cuò)的選擇，但需權(quán)衡方法的抗干擾性，如pH的微小變化（小于0.1單位）導(dǎo)致峰保留的變化（pH接近一種或多種化合物的pKa），可通過精確量取緩沖劑組成（重量或體積）以精密控制pH值，而不是用pH計(jì)將緩沖劑滴定至理想的pH，日常方法開發(fā)，盡量避免該條件，方法耐受性非常差，風(fēng)險(xiǎn)極大。

4、偏中性條件硅羥基對(duì)弱堿性化合物的影響，對(duì)于堿性化合物會(huì)與其形成吸附，導(dǎo)致拖尾，解決辦法分別為更換色譜柱、用高濃度的緩沖鹽（>10mM），選擇被硅羥基牢固保留的緩沖鹽陽(yáng)離子（Na+<k+<nh4+<三乙胺+）。< p=""></k+<nh4+<三乙胺+）。<>

5、偏中性條件硅羥基對(duì)電負(fù)性強(qiáng)的化合物的影響（比溶劑出峰還靠前），一個(gè)案例，有一雜質(zhì)在中性色譜條件下，在溶劑前出峰，調(diào)整該方法流動(dòng)相至酸性條件，該雜質(zhì)在色譜柱上有保留。

6、在混合磷酸三乙胺或醋酸三乙胺時(shí)，應(yīng)先加入磷酸鹽或醋酸鹽然后再加三乙胺，因?yàn)榧內(nèi)�乙胺可能不溶于水。在用醋酸銨/甲酸銨控制pH時(shí)，由于該鹽吸濕性較強(qiáng)，需確定不同摩爾濃度對(duì)分離的影響。確保方法的適用性。

甲醇/乙腈的選擇

反向色譜最常用的甲醇或乙腈，甲醇的截至波長(zhǎng)為205nm，乙腈的截至波長(zhǎng)為190nm，乙腈水系統(tǒng)由于其粘度非常低，塔板數(shù)較高而柱壓較低，是流動(dòng)相的最佳選擇。通常40%的乙腈具有與50%的甲醇相似的溶劑強(qiáng)度。

基于溶劑不同的選擇性，甲醇為類質(zhì)子溶劑，可形成氫鍵，對(duì)于分離酸堿或電負(fù)性強(qiáng)的化合物有提高選擇性，乙腈為極性分子，其碳氮三鍵含有未成鍵電子，能與含有空軌道的化合物結(jié)合，則與甲醇有著不同的化合物選擇性。有時(shí)單用ACN或MEOH可能會(huì)達(dá)不到理想的分離效果，在流動(dòng)相同時(shí)使用ACN和MEOH可改變選擇性以獲得較好的分離效果。簡(jiǎn)言之，在改變分離選擇性的時(shí)候，甲醇細(xì)調(diào)，乙腈粗調(diào)。主要是為了調(diào)整流動(dòng)相的粘度和強(qiáng)度，使得分離效果和選擇性有所改善。

離子對(duì)的選擇

適用范圍：使用液相色譜法分析電離能力比較強(qiáng)的樣品時(shí)，樣品在反相色譜柱上的保留時(shí)間很短或者根本不保留，這時(shí)要加入相應(yīng)的離子對(duì)試劑，將分析物上的離子進(jìn)行結(jié)合，形成在柱子上有保留的分子。

作用原理：加入離子對(duì)試劑后，它可以與待分析的物質(zhì)（多為在溶液狀態(tài)時(shí)顯以與離子對(duì)試劑相反的電荷）結(jié)合成離子對(duì)而呈中性，疏水性增加而在色譜柱上有保留行為。離子對(duì)類似于膠黏劑，一頭以離子吸引住待測(cè)物（也是離子），另一頭以碳鏈與固定性作用，從而把待測(cè)物保持在固定相上。

試劑選擇：離子對(duì)分為正離子對(duì)和負(fù)離子對(duì)，分析酸性樣品（確切的說應(yīng)該是作用基團(tuán)）用正離子對(duì)試劑，分析堿性樣品用負(fù)離子對(duì)試劑。正離子對(duì)試劑可以吸附帶負(fù)電荷的樣品組分，負(fù)離子對(duì)試劑反之。戊烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉.....十二烷基磺酸鈉屬于負(fù)離子對(duì)試劑；四丁基溴化銨、四丁基硫酸氫銨、四丁基氫氧化銨等屬于正離子對(duì)試劑。離子對(duì)要考慮樣品體系的復(fù)雜性和干擾物的特性，先用碳鏈短的，濃度盡量低，降低對(duì)色譜柱填料的影響，同時(shí)流動(dòng)相的pH值盡可能低以確保離子化程度。

離子對(duì)試劑的濃度：通過改變被固定相吸附的離子對(duì)試劑的多少，有可能將保留過程由反相改變?yōu)殡x子交換色譜。這種改變是通過改變流動(dòng)相中的試劑的濃度實(shí)現(xiàn)的。同常濃度范圍從幾毫摩到幾十毫摩不等。

注意事項(xiàng)：三乙胺、醋酸銨也起到部分離子對(duì)試劑的作用，使用離子對(duì)的色譜柱建議專柱專用。

等度與梯度的選擇

梯度洗脫用于方法建立，對(duì)于組分未知的樣品進(jìn)行HPLC方法建立時(shí)，即使最終分離擬用等度洗脫仍需先采用梯度洗脫進(jìn)行方法開發(fā)。目的為確定以下幾項(xiàng)：

1、初始梯度洗脫分離可以近似估計(jì)出樣品的保留值范圍，為后續(xù)試驗(yàn)選擇等度或梯度提供必要的依據(jù)。

2、若等度洗脫是最好選擇，初始梯度試驗(yàn)可為進(jìn)一步試驗(yàn)提供最佳%B的估算值。

3、初始梯度洗脫實(shí)驗(yàn)可以使整體樣品分離更好、更快。

4、初始梯度洗脫遺漏早與晚流出的低濃度組分的可能性較小。

5、初始梯度通常為線性梯度（全梯度），如5—100%B，根據(jù)雜質(zhì)情況，1.5梯度/min或5梯度/min，進(jìn)行試驗(yàn)。

     梯度洗脫時(shí)由于改性劑在水相的吸收與有機(jī)相中的吸收不同，導(dǎo)致基線漂移，可通過混合流動(dòng)相的方式進(jìn)行改善。