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細(xì)菌性微生物是我國導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要病因，據(jù)統(tǒng)計(jì)每年我國食源性致病菌導(dǎo)致數(shù)千萬人次發(fā)病，嚴(yán)重危及人們的健康，由此造成的損失巨大，成為目前較為突出的公共衛(wèi)生問題之一。其中主要食源性致病菌包括沙門氏菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希氏菌、副溶血性弧菌、和蠟樣芽胞桿菌等，尤其是蠟樣芽孢桿菌引發(fā)的食物中毒問題越來越受到人們的關(guān)注。
“炒飯綜合征”，即蠟樣芽孢桿菌引起的食源性疾病，具有明顯的季節(jié)性，多發(fā)生在6月到10月；被蠟樣芽孢桿菌污染的食品，外觀一般無明顯變化，看不到腐敗變質(zhì)現(xiàn)象，因此難以通過肉眼辨別是否受蠟樣芽孢桿菌污染。污染的食品常因?yàn)槭城氨４鏈囟炔划?dāng)(26～37℃)，放置時(shí)間較長，或加工不當(dāng)?shù)仍蚴故称分形廴镜南灅友挎邨U菌得以生長繁殖。少量攝入蠟樣芽孢桿菌不會引起食物中毒，只有其在食物中成指數(shù)生長才會產(chǎn)生腸毒素。一般認(rèn)為蠟樣芽孢桿菌引起的食物中毒屬毒素型食物中毒。
NO.01
蠟樣芽胞桿菌簡介
蠟樣芽胞桿菌，是一種條件致病菌，通�？稍谑覝叵麻L時(shí)間放置的炒飯或米飯中發(fā)現(xiàn)，由其引起的病癥通常成為“炒飯綜合征”。該菌生長的最適溫度為28℃～37℃，其繁殖體較耐熱，需100℃×20分鐘才被殺死，其芽胞可耐受100℃×30分鐘或干熱120℃×60分鐘才能被殺死，這也是它不同于其他食源性致病菌的重要特征。
蠟樣芽胞桿菌廣泛存在于自然界中，通常生活在土壤、灰塵和水體中。易污染該菌的食品為米制品、乳制品、腐乳、泡菜、熟肉及熟菜、調(diào)料、蛋羹、湯類及生的蔬菜等。被蠟樣芽胞桿菌污染的食品，外觀一般無明顯變化，除米飯有時(shí)稍有發(fā)餿、口味不爽外，大多數(shù)食品感觀性狀正常，不易發(fā)現(xiàn)腐敗變質(zhì)跡象。因此難以通過肉眼辨別是否受蠟樣芽胞桿菌污染。夏季氣溫更接近于蠟樣芽胞桿菌的最適生長溫度，因此該季節(jié)是炒飯綜合征的高峰期。
NO.02
蠟樣芽胞桿菌食物中毒情況及原因
蠟樣芽胞桿菌食物中毒是由食物中的大量活菌和該菌產(chǎn)生的毒素引起，該菌食物中毒發(fā)病率較高，一般為60%～100%，預(yù)后良好，無死亡。中毒的癥狀有兩種類型：一種是腹瀉型，由蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生的腸毒素引起，腸毒素不耐熱，在45℃×30分鐘或56℃×5分鐘的情況下，毒素會被破壞失去毒性，此類型食物中毒較少。另一種是嘔吐型，由蠟樣芽胞桿菌產(chǎn)生的催吐毒素引起，該類食物中毒比腹瀉型更嚴(yán)重。催吐毒素在加熱126℃×90分鐘的情況下，毒素都不會被破壞，含有毒素的食品即使高溫加熱仍可以引起人類中毒，因此國內(nèi)報(bào)道的該菌食物中毒多為此型。引起嘔吐型食物中毒的主要食品是米飯及其制品（80%以上），涼面、豆腐也可以引發(fā)。
NO.03
蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)及限量要求
我國現(xiàn)行《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 散裝即食食品中致病菌限量》（GB 31607-2021）規(guī)定第一類（制作過程中，所有組分均經(jīng)徹底加熱處理，存儲后銷售的散裝即食食品）和第二類（制作過程中，加入了未徹底加熱處理組分或生鮮組分，經(jīng)或未經(jīng)存儲后銷售的散裝即食食品）中以米為主要原料制作的食品中蠟樣芽胞桿菌不得超過10000 CFU/g（mL）。香港《即食食品微生物含量索引》和澳門《即食食物的微生物含量判定指引》均規(guī)定一般即食食品中蠟樣芽胞桿菌不得超過100000 CFU/g，同時(shí)滿意范圍為小于1000 CFU/g。
國際上，澳大利亞和新西蘭的即食食品微生物限量標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定蠟樣芽胞桿菌和其他致病性芽胞桿菌不得超過10000 CFU/g，同時(shí)滿意范圍為小于100 CFU/g。英國即食食品微生物限量要求蠟樣芽胞桿菌和其他致病性芽胞桿菌不得超過100000 CFU/g，滿意范圍為小于1000 CFU/g。韓國規(guī)定即食食品和新鮮的即食食品中蠟樣芽胞桿菌和其他致病性芽胞桿菌不得超過1000 CFU/g。
我國現(xiàn)行檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為GB 4789.14-2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)》。
NO.04
蠟樣芽胞桿菌檢驗(yàn)
蠟樣芽胞桿菌的檢驗(yàn)原理為根據(jù)其在特定培養(yǎng)基上特定的生長、形態(tài)和生理生化特征，首先將樣品中的微生物細(xì)胞均勻分散在稀釋液中，再將稀釋液涂布在MYP瓊脂平板上30℃培養(yǎng)24小時(shí)后，挑取典型菌落在營養(yǎng)瓊脂上純培養(yǎng)；隨后進(jìn)行染色鏡檢、生化鑒定、動力試驗(yàn)、溶血試驗(yàn)、根狀生長試驗(yàn)、溶菌酶耐性試驗(yàn)、蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)等確證試驗(yàn)；最后根據(jù)計(jì)數(shù)和確證試驗(yàn)的結(jié)果計(jì)算蠟樣芽胞桿菌的數(shù)量。
2.1樣品處理
冷凍樣品應(yīng)在45℃以下不超過15 min或在2℃～5℃不超過18 h解凍，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)放于-10℃~-20℃保存；非冷凍而易腐的樣品應(yīng)盡可能及時(shí)檢驗(yàn)，若不能及時(shí)檢驗(yàn)，應(yīng)置于2℃～5℃冰箱保存，24 h內(nèi)檢驗(yàn)。
2.2樣品制備
稱取樣品25 g，放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi)，用旋轉(zhuǎn)刀片式均質(zhì)器以8000r/min～10000 r/min均質(zhì)1 min
～2 min，或放入盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min～2 min。若樣品為液態(tài)，吸取25 mL樣品至盛有225 mL PBS或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)可預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)中，振蕩混勻，作為1:10的樣品勻液。
2.3樣品的稀釋
吸取2.2中1:10的樣品勻液1 mL加到裝有9mL PBS或生理鹽水的稀釋管中，充分混勻制成1:100的樣品勻液。跟據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次，換用1支1mL無菌吸管或吸頭。
2.4樣品接種
根據(jù)對樣品污染狀況的估計(jì)，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），以0.3mL、0.3 mL、0.4 mL接種量分別移入三塊MYP瓊脂平板，然后用無菌L棒涂布整個(gè)平板，注意不要觸及平板邊緣。使用前，如MYP瓊脂平板表面有水珠，可放在25℃～50℃的培養(yǎng)箱里干燥，直到平板表面的水珠消失。
2.5分離、培養(yǎng)
2.5.1分離
在通常情況下，涂布后，將平板靜置10 min。如樣液不易吸收，可將平板放在培養(yǎng)箱30℃±1℃培養(yǎng)1 h，等樣品勻液吸收后翻轉(zhuǎn)平皿，倒置于培養(yǎng)箱，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24 h±2 h再觀察。在MYP瓊脂平板上，典型菌落為微粉紅色(表示不發(fā)酵甘露醇)，周圍有白色至淡粉紅色沉淀環(huán)（表示產(chǎn)卵磷脂酶）。
MYP瓊脂平板
2.5.2純培養(yǎng)
從每個(gè)平板中挑取至少5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），分別劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)。在營養(yǎng)瓊脂平板上，典型菌落為灰白色，偶有黃綠色，不透明，表面粗糙似毛玻璃狀或融蠟狀，邊緣常呈擴(kuò)展?fàn)睿睆綖? mm～10 mm。
2.6確定鑒定
2.6.1染色鏡檢
挑取純培養(yǎng)的單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢。蠟樣芽胞桿菌為革蘭氏陽性芽胞桿菌，大小為（1μm～1.3μm）×（3μm～5μm），芽胞呈橢圓形位于菌體中央或偏端，不膨大于菌體，菌體兩端較平整，多呈短鏈或長鏈狀排列。
2.6.2生化鑒定
2.6.2.1 生化特征
本菌有動力;產(chǎn)生卵磷脂酶和酪蛋白酶;過氧化氫酶試驗(yàn)陽性;溶血;不發(fā)酵甘露醇和木糖;能液化明膠和還原硝酸鹽;在厭氧條件下能發(fā)酵葡萄糖。具體見表1。
2.6.2.2動力試驗(yàn)
用接種針挑取培養(yǎng)物穿刺接種于動力培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)24h。有動力的蠟樣芽胞桿菌應(yīng)沿穿刺線呈擴(kuò)散生長，而蕈狀芽孢桿菌常呈“絨毛狀”生長。也可用懸滴法檢查。
2.6.2.3溶血試驗(yàn)
挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落接種于TSSB瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。蠟樣芽胞桿菌菌落為淺灰色，不透明，似白色毛玻璃狀，有草綠色溶血環(huán)或完全溶血環(huán)。蘇云金芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌呈現(xiàn)弱的溶血現(xiàn)象，而多數(shù)炭疽芽胞桿菌為不溶血，巨大芽胞桿菌為不溶血。
2.6.2.4根狀生長試驗(yàn)
挑取單個(gè)可疑菌落按間隔2cm～3cm左右距離劃平行直線于經(jīng)室溫干燥1d～2d的營養(yǎng)瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24h～48h，不能超過72h。用蠟樣芽胞桿菌和蕈狀芽胞桿菌標(biāo)準(zhǔn)株作為對照進(jìn)行同步試驗(yàn)。蕈狀芽胞桿菌呈根狀生長的特征。蠟樣芽胞桿菌菌株呈粗糙山谷狀生長的特征。
2.6.2.5溶菌酶耐性試驗(yàn)
用接種環(huán)取純菌懸液一環(huán)，接種于溶菌酶肉湯中，36℃±1℃培養(yǎng)24 h。蠟樣芽胞桿菌在本培養(yǎng)基（含0.001%溶菌酶）中能生長。如出現(xiàn)陰性反應(yīng)，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)24 h。巨大芽胞桿菌不生長。
2.6.2.6蛋白質(zhì)毒素結(jié)晶試驗(yàn)
挑取純培養(yǎng)的單個(gè)可疑菌落接種于硫酸錳營養(yǎng)瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h，并于室溫放置3 d～4 d，挑取培養(yǎng)物少許于載玻片上，滴加蒸餾水混勻并涂成薄膜。經(jīng)自然干燥，微火固定后，加甲醇作用30 s后傾去，再通過火焰干燥，于載玻片上滴滿0.5%堿性復(fù)紅，放火焰上加熱（微見蒸氣，勿使染液沸騰)持續(xù)1 min～2 min，移去火焰，再更換染色液再次加溫染色30 s，傾去染液用潔凈自來水徹底清洗、晾干后鏡檢。觀察有無游離芽胞（淺紅色）和染成深紅色的菱形蛋白結(jié)晶體。如發(fā)現(xiàn)游離芽胞形成的不豐富，應(yīng)再將培養(yǎng)物置室溫2 d～3 d后進(jìn)行檢查。除蘇云金芽胞桿菌外，其他芽胞桿菌不產(chǎn)生蛋白結(jié)晶體。
3.1典型菌落計(jì)數(shù)和確認(rèn)
3.1.1
選擇有典型蠟樣芽胞桿菌菌落的平板，且同一稀釋度3個(gè)平板所有菌落數(shù)合計(jì)在20CFU～200CFU之間的平板，計(jì)數(shù)典型菌落數(shù)。如果出現(xiàn)a）~f）現(xiàn)象按4.4.2.1中公式（1）計(jì)算：
a）只有一個(gè)稀釋度的平板菌落數(shù)在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
b）2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU之間，但只有一個(gè)稀釋度的平板有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
c）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均小于20 CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最低稀釋度平板上的典型菌落；
d）某一稀釋度的平板菌落數(shù)大于200 CFU且有典型菌落，但下一稀釋度平板上沒有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)該稀釋度平板上的典型菌落；
e）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均大于200 CFU且有典型菌落，應(yīng)計(jì)數(shù)最高稀釋度平板上的典型菌落；
f）所有稀釋度的平板菌落數(shù)均不在20 CFU～200 CFU之間且有典型菌落，其中一部分小于20 CFU或大于200CFU時(shí)，應(yīng)計(jì)數(shù)最接近20 CFU或200 CFU的稀釋度平板上的典型菌落。
如果出現(xiàn)g）現(xiàn)象則按4.4.2.2中公式（2）計(jì)算：
g)2個(gè)連續(xù)稀釋度的平板菌落數(shù)均在20 CFU～200 CFU之間且均
有典型菌落。
4.1根據(jù)MYP平板上蠟樣芽胞桿菌的典型菌落數(shù)，按3.1中公式（1）、公式（2）計(jì)算，報(bào)告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌菌數(shù)，以CFU/g（mL）表示；如T值為0，則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)報(bào)告。
4.2必要時(shí)報(bào)告蠟樣芽胞桿菌生化分型結(jié)果。
樣品處理、樣品制備、樣品的稀釋同平板法操作；
樣品接種：取3個(gè)適宜連續(xù)稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），接種于10 mL胰酪胨大豆多黏菌素肉湯中，每一稀釋度接種3管，每管接種1 mL（如果接種量需要超過1 mL，則用雙料胰酪胨大豆多黏菌素肉湯）。于30℃±1℃培養(yǎng)48 h±2 h。
培養(yǎng)：
用接種環(huán)從各管中分別移取1環(huán)，劃線接種到MYP瓊脂平板上，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h。如果菌落不典型，可繼續(xù)培養(yǎng)24 h±2 h再觀察。
確定鑒定
從每個(gè)平板選取5個(gè)典型菌落（小于5個(gè)全選），劃線接種于營養(yǎng)瓊脂平板做純培養(yǎng)，30℃±1℃培養(yǎng)24 h±2 h，進(jìn)行確證實(shí)驗(yàn)，同平板法。
根據(jù)證實(shí)為蠟樣芽胞桿菌陽性的試管管數(shù)，查MPN檢索表（見附錄B），報(bào)告每g（mL）樣品中蠟樣芽胞桿菌的最可能數(shù)，以MPN/g（mL）表示。
