其實(shí)我們一般微生物實(shí)驗(yàn)室自己還是可以做一些工作，特別是細(xì)菌的鑒定。再就是菌種鑒定時(shí)，不是直接拿來(lái)就鑒定，需要一些預(yù)先做一些處理或判斷�，F(xiàn)將一些基礎(chǔ)知識(shí)進(jìn)行總結(jié)如下：

一、相關(guān)定義

1、生理生化鑒定：根據(jù)微生物對(duì)各種生理?xiàng)l件（溫度、pH、氧氣、滲透壓）、生化指標(biāo)（唯一碳氮源、抗生素、酶、鹽堿性）代謝反應(yīng)進(jìn)行分析，并將結(jié)果轉(zhuǎn)化成軟件可以識(shí)別的數(shù)據(jù)，進(jìn)行聚類分析，與已知的參比菌株數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比較，最終對(duì)未知菌進(jìn)行鑒定的一種技術(shù)。

2、革蘭氏染色：系細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，染色后細(xì)菌與環(huán)境形成鮮明對(duì)比，可以清楚地觀察到細(xì)菌的形態(tài)、排列及某些結(jié)構(gòu)特征，而用以分類鑒定。

3、平板劃線法：系指把雜菌樣品通過在平板表面劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

4、氧化酶試驗(yàn)：氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應(yīng)，而是先使細(xì)胞色素C氧化，然后此氧化型細(xì)胞色素C再使對(duì)苯二胺氧化，產(chǎn)生顏色反應(yīng)而進(jìn)行的試驗(yàn)，用于區(qū)分不發(fā)酵的革蘭陰性桿菌（氧化酶陽(yáng)性）和腸道菌（氧化酶陰性）。

5、觸酶試驗(yàn)：大多需氧和兼性厭氧菌均產(chǎn)生過氧化氫酶，但鏈球菌屬陰性，故常用此試驗(yàn)來(lái)鑒定，用于區(qū)分葡萄球菌(過氧化氫酶陽(yáng)性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）。

6、凝固酶試驗(yàn)：用于區(qū)分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測(cè)為非致病性）和凝固酶陽(yáng)性葡萄球菌(很可能為致病性）。

二、工作程序

1、微生物鑒定程序

微生物鑒定的基本程序包括分離純化和鑒定，鑒定時(shí)一般先將待檢菌進(jìn)行初步的分類。鑒定的方法有表型微生物鑒定和基因型微生物鑒定，根據(jù)所需要達(dá)到的鑒定水平選擇鑒定方法。目前實(shí)驗(yàn)室室進(jìn)行表型微生物鑒定后可以用API試劑條進(jìn)行或其他等效的試劑條進(jìn)行菌種鑒定，如API試劑條鑒定不能滿足要求時(shí)采取委外鑒定。

注：為了控制成本，可以自己進(jìn)行鑒定，不具備能力時(shí)再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限，需要注意效期或跟供應(yīng)商做好溝通備貨。

1.1 待檢菌的分離與純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養(yǎng)物的分離純化，最常用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養(yǎng)物（單個(gè)菌落），必要時(shí)可進(jìn)一步進(jìn)行純培養(yǎng)，為表型鑒定和隨后的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、制藥用水、生產(chǎn)環(huán)境、中間產(chǎn)品和最終產(chǎn)品的樣品中檢出的受損微生物，經(jīng)分離純化程序使其由不利生存易產(chǎn)生變化的狀態(tài)變?yōu)樵跔I(yíng)養(yǎng)富集和最佳培養(yǎng)溫度條件下生存的穩(wěn)定狀態(tài)，以保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，具體詳見表1。

表1待檢菌的分離與純化明細(xì)表

1.1.1 平板劃線法

平板劃線方法一般通過連續(xù)畫蛇形曲線或四區(qū)劃線方法進(jìn)行。四區(qū)劃線具體步驟如下：先在平皿上做好標(biāo)識(shí)，然后在選擇所獲得的新鮮菌種進(jìn)行劃線；左手持無(wú)菌平板，拇指和食指控制皿蓋，其余指控制皿底，打開皿蓋，用接種環(huán)在皿上進(jìn)行劃線，一區(qū)要連續(xù)緊密的幾根平行線（如果菌量過多可以更換接種環(huán)），二區(qū)緊著著一區(qū)的最后一根線帶出來(lái)，劃幾根平行線，然后三區(qū)、四區(qū)同樣的操作，四區(qū)應(yīng)盡量避免接觸到菌落密集區(qū)，影響單菌落的形成；最后再選擇適宜的溫度進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.2 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一系列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分別取不同稀釋液少許，與已熔化并冷卻至50℃左右的瓊脂培養(yǎng)基混合，搖勻后，傾入滅過菌的培養(yǎng)皿中，待瓊脂凝固后，制成可能含菌的瓊脂平板，保溫培養(yǎng)一定時(shí)間即可出現(xiàn)菌落。

如果稀釋得當(dāng)，在平板表面或瓊脂培養(yǎng)基中就可出現(xiàn)分散的單個(gè)菌落，這個(gè)菌落可能就是由一個(gè)細(xì)菌細(xì)胞繁殖形成的。隨后挑取該單個(gè)菌落，或重復(fù)以上操作數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)。

1.1.3 涂布平板法

因?yàn)閷⑽⑸�物懸液先加到較燙的培養(yǎng)基中再倒平板易造成某些熱敏感菌的死亡，且采用稀釋倒平板法也會(huì)使一些嚴(yán)格好氧菌因被固定在瓊脂中間缺乏氧氣而影響其生長(zhǎng)，因此在微生物學(xué)研究中常用的純種分離方法是涂布平板法。

其做法是先將已熔化的培養(yǎng)基倒入無(wú)菌平皿，制成無(wú)菌平板，冷卻凝固后，將一定量的微生物懸液滴加在平板表面，再用無(wú)菌玻璃涂棒將菌液均勻分散至整個(gè)平板表面，經(jīng)培養(yǎng)后挑取單個(gè)菌落。

1.2 初篩實(shí)驗(yàn)

常規(guī)的微生物鑒定，一般要先進(jìn)行初篩試驗(yàn)確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌進(jìn)行初步分類。常見的初篩試驗(yàn)包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結(jié)果和細(xì)胞形態(tài)、重要的生化反應(yīng)等。

1.2.1 革蘭氏染色

原理：檢查細(xì)菌細(xì)胞壁的滲透性，染色前所有細(xì)胞是透明的，結(jié)晶紫著色后用碘增加染料與菌體結(jié)合，乙醇從G(-)菌體洗脫結(jié)晶紫，用番紅液復(fù)染，革蘭氏陰性菌呈粉紅色，革蘭氏陽(yáng)性菌呈藍(lán)紫色。

染色步驟：一般按照染色液說明書規(guī)定進(jìn)行染色，如說明書無(wú)明確說明時(shí)按以下步驟進(jìn)行染色。結(jié)晶紫初染，在載玻片上滴一小滴純化水，用灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌，置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開，涂抹要均勻平坦，涂抹后直徑約為1cm的薄層。

將載玻片在火焰上方快速來(lái)回通過一兩次，以載玻片的加熱面接觸手背皮膚，不覺過燙為佳，待冷卻后再在火焰上方來(lái)回通過一兩次，再冷卻，重復(fù)操作直到薄層干燥為止；在制好的片上滴一滴草酸銨結(jié)晶紫，染色1min后用水洗；碘液媒染，加碘液一滴，作用1min后用水沖洗，用過濾紙吸干；乙醇脫色，用95%乙醇脫色，脫色時(shí)間大概為30s。水洗后用過濾紙吸干；番紅復(fù)染，滴加0.5%的番紅染色液一滴，染色10～30s后，用自來(lái)水沖洗。

鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡，最后油鏡觀察，觀察菌落形態(tài)與菌落顏色，菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌，呈藍(lán)紫色為革蘭氏陽(yáng)性菌。

1.2.2 芽孢染色

一般按照染色液使用說明進(jìn)行芽孢染色。如無(wú)明確說明時(shí)按以下步驟進(jìn)行芽孢染色。涂片，先在載玻片上滴一滴純化水，用接種環(huán)灼燒過的接種針挑取少量細(xì)菌，置載玻片的水滴中與水混合并涂抹開，涂抹要均勻平坦，涂抹后直徑約為1cm的薄層。

干燥固定，將載玻片在火焰上方快速來(lái)回通過一兩次，以載玻片的加熱面接觸手背皮膚，不覺過燙為佳，待冷卻后再在火焰上方來(lái)回通過一兩次，再冷卻，重復(fù)操作直到薄層干燥為止。孔雀綠覆蓋，用木夾夾住載玻片一端，加數(shù)滴5%孔雀綠染液覆蓋涂片，在微火上加熱至染料冒蒸汽并開始計(jì)時(shí)，維持5min。

沖洗，待玻片冷卻后，用緩流自來(lái)水沖洗載玻片背面，直至流出的水無(wú)色為止。復(fù)染，用0.5%番紅染液覆蓋玻片，保持3min。水洗干燥，用緩流自來(lái)水沖洗載玻片背面，直至流出的水無(wú)色為止，使其自然干燥。鏡檢，觀察菌落是否含有芽孢。

1.2.3 氧化酶試驗(yàn)（革蘭氏陰性桿菌）

革蘭氏陰性菌，做氧化酶試驗(yàn)。取將待檢菌落于無(wú)菌的濾紙片上，滴加一滴氧化酶試劑，反應(yīng)3分鐘，出現(xiàn)紫色為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.2.4 非發(fā)酵菌鑒定

接種前把OF培養(yǎng)基在沸水浴溶解，在室溫冷卻后,每試驗(yàn)分裝2個(gè)安培的固體OF培養(yǎng)基，利用接種針挑單個(gè)菌落,穿刺到OF培養(yǎng)基(深度約1cm)，把其中一個(gè)已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個(gè)安培蓋上塑料帽,培養(yǎng)35-37°C , 24–48小時(shí)。

結(jié)果判定：兩瓶均為黃色，則為發(fā)酵菌，則為發(fā)酵菌，兩管培養(yǎng)基一瓶顯示綠色F-，一瓶顯示黃色O+。

1.2.5 觸酶試驗(yàn)（革蘭氏陽(yáng)性菌）

玻片法：挑取被撿菌落于玻片上，直接用試劑進(jìn)行乳化，5s內(nèi)產(chǎn)生氣泡即為陽(yáng)性結(jié)果，反之為陰性。

1.3 表型微生物鑒定

表型微生物鑒定依據(jù)表型特征的表達(dá)來(lái)區(qū)分不同微生物間的差異，是經(jīng)典的微生物分類鑒定法，以微生物細(xì)胞的形態(tài)和習(xí)性表型為主要指標(biāo)，通過比較微生物的菌落形態(tài)、理化特征和特征化學(xué)成分與典型微生物的差異進(jìn)行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

表2 微生物分類中使用的表性特征表

1.4 API試劑條的使用

1.4.1 API試劑條的選條標(biāo)準(zhǔn)

根據(jù)API系統(tǒng)選條標(biāo)準(zhǔn)，來(lái)選擇適合的API鑒別條來(lái)鑒別。如革蘭氏陽(yáng)性球菌：觸酶試驗(yàn)陽(yáng)性為葡萄球菌用API STAPH鑒別，觸酶試驗(yàn)陰性為鏈球菌用API 20 STREP鑒別。

1.4.2 API試劑條的操作步驟

1.4.2.1 分離單個(gè)菌落：用一次性無(wú)菌接種環(huán)或已滅菌棉簽挑單個(gè)可疑菌落，盡量避免使用高度選擇性培養(yǎng)基。

1.4.2.2 安瓿瓶的開啟：蓋上安瓿開啟器，用手垂直握住安瓿瓶（白色塑料瓶蓋朝上），盡量將瓶蓋壓下，用大拇指頂住瓶蓋上斜面部分，同時(shí)用拇指向外加壓。

1.4.2.3 制菌懸液：將挑取的單個(gè)菌落置于含0.85%氯化鈉溶液或懸浮培養(yǎng)基5ml的安培瓶，混勻。

1.4.2.4 測(cè)定菌懸液濁度：

1.4.2.4.1 菌液的加入：將5mL無(wú)菌水放入培養(yǎng)盒以提供濕潤(rùn)的培養(yǎng)環(huán)境，同時(shí)放入試紙條，將菌液接種到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL)，利用石臘油覆蓋指定的生化孔(有劃線的孔ADH，ODC，H2S 和URE)，蓋上培養(yǎng)蓋。

1.4.2.4.2 培養(yǎng)：把試紙條放進(jìn)培養(yǎng)箱內(nèi)，利用指定溫度及時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)（如API20E : 35~37℃，18-24小時(shí)）。

1.4.2.4.3 附加試劑加入：培養(yǎng)結(jié)束后，按操作說明書規(guī)定，將附加試劑加進(jìn)適當(dāng)小孔內(nèi)。

1.4.2.4.4 結(jié)果分析：登錄APIWEB,試紙條上每三個(gè)小孔（小管）作為一組，記分分別為1、2、4分，將試紙條的顯色情況進(jìn)行輸入，進(jìn)行結(jié)果對(duì)比判讀。

1.4.2.5 結(jié)果判讀原理：

生化結(jié)果組合跟資料庫(kù)內(nèi)的典型條目(Taxa)作出比較，經(jīng)計(jì)算後，鑒定百比率（%Id）＝機(jī)會(huì)率，指示出不同菌類的比較，T值指示出在同一個(gè)菌類的相似程度。依據(jù)T值及%Id的組合，作出評(píng)語(yǔ)：

極好的鑒定結(jié)果          %Id >99.9及T>0.75  
很好的鑒定結(jié)果          %Id >99.0及T>0.50  
好的鑒定結(jié)果              %Id >90.0及T>0.25  
可以接受的鑒定結(jié)果   %Id >80.0及T>0  
可疑的生化譜              N/A