國(guó)內(nèi)常見(jiàn)微生物檢驗(yàn)所用的菌種代號(hào)是:
CMCC(F)或 CMCC(B)
CMCC —— 中國(guó)醫(yī)學(xué)菌種保藏中心
B —— 代表細(xì)菌, F ——代表真菌。
大腸桿菌 [CMCC (B) 44102];
乙型副傷寒沙門桿菌 [CMCC (B) 50094];
銅綠假單胞菌 [CMCC (B)10104];
金黃色葡萄球菌 [CMCC (B)26003];
生孢梭菌[CMCC(B)64941];
白色念珠菌[CMCC(F)98001]。
常用菌種保藏方法
(一) 菌種保藏的原理
根據(jù)微生物的菌種生理、生化特性,在人工創(chuàng)造的條件下盡量降低微生物細(xì)胞的代謝強(qiáng)度,使細(xì)胞基本處于休眠狀態(tài),生長(zhǎng)繁殖受到抑制但又不至于死亡,以減低菌種的變異率。低溫、干燥、缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)等環(huán)境條件都有抑制微生物的代謝作用。
低溫、干燥、真空是用于菌種保藏的重要手段。
選擇保藏方法時(shí),首先應(yīng)考慮方法能否長(zhǎng)期地保持菌種原有的特性,同時(shí)也應(yīng)兼顧到方法的經(jīng)濟(jì)和簡(jiǎn)便。在實(shí)際工作中,往往多種條件同時(shí)使用,以提高保藏效果。
(二)菌種保藏步驟
① 挑選特征典型的純菌菌落;
② 確定保藏的合適菌體形態(tài);
③ 選擇最適宜的保藏方法;
④ 定期對(duì)保藏菌種進(jìn)行檢查,觀察是否發(fā)生變化,若有變化,須改變保藏方法。保藏期滿應(yīng)及時(shí)進(jìn)行移種。
1.瓊脂斜面低溫保存法
(1)方法:將經(jīng)常使用的菌種的典型菌落接種在斜面(某些特殊菌種可用液體培養(yǎng)基)上,按規(guī)定的溫度和時(shí)間培養(yǎng),待充分生長(zhǎng)后,把培養(yǎng)好的新鮮菌種用牛皮紙保好,為減緩培養(yǎng)基的水分蒸發(fā),延長(zhǎng)保藏時(shí)間,可將菌種保藏管的棉花塞換成橡膠塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔 2~3個(gè)月移種一次,繼續(xù)進(jìn)行保藏。若用半固體高層培養(yǎng)基穿刺培養(yǎng),一般可保藏半年 ~ 一年。有的甚至更長(zhǎng)時(shí)間。
(2)適用范圍:細(xì)菌、酵母菌、霉菌保藏。
(3)特點(diǎn):優(yōu)點(diǎn)是——簡(jiǎn)便,易于推廣;一般不需要另選擇保藏用培養(yǎng)基;對(duì)大多數(shù)微生物都適用;缺點(diǎn)是——保藏期太短;傳代次數(shù)多,易發(fā)生變異及污染。
(4)注意事項(xiàng):保藏的菌種應(yīng)是生命活力旺盛的新鮮培養(yǎng)物,至少應(yīng)是第三代的培養(yǎng)物。
保藏時(shí),破傷風(fēng)桿菌可用庖肉培養(yǎng)基;生孢梭菌用流體硫乙醇酸鹽培養(yǎng)基。必須定期檢查保藏菌種冰箱的溫度、濕度以及菌種管的棉塞是否松動(dòng)或生霉,如有異常應(yīng)及時(shí)處理。
每次移植后,應(yīng)與原菌種的編號(hào)、名稱逐一核對(duì),確證培養(yǎng)基特征和純度無(wú)誤后再繼續(xù)保藏。
保藏菌種的培養(yǎng)基應(yīng)無(wú)糖,其他菌類含糖小于2%為宜,以免產(chǎn)酸過(guò)多,影響菌種存活。
銅綠假單胞菌在冰箱中易發(fā)生菌體自溶而死亡,不宜用本法保存。
2、液體石蠟保存法:
本法是用石蠟將培養(yǎng)物與空氣隔絕,以降低菌種的生理生化水平,并可防止水分蒸發(fā),從而延長(zhǎng)菌種的保藏期。
(1)方法:將菌種接種于斜面或穿刺于0.3~0.5 %瓊脂半固體高層培養(yǎng)基中,培養(yǎng)好備用。取化學(xué)純的液體石蠟裝在試管中,每管10~15mL,加棉塞,瓶口包上紙,121℃高壓滅菌30min,取出置37℃溫箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器內(nèi)除去液體石蠟中的水分。
將上述液體石蠟加入培養(yǎng)好的菌種試管內(nèi),液體石蠟液面以高出培養(yǎng)基最上端1㎝為宜,將試管直立,放入4℃冰箱中保藏。
(2)適用范圍:適用于保藏部分霉菌,酵母菌和放線菌,對(duì)細(xì)菌保藏效果較差。
(3)特點(diǎn):本方法簡(jiǎn)便易行,是實(shí)驗(yàn)室常用的一種保藏方法,該法主要使菌種與空氣隔絕。
(4)注意事項(xiàng):
① 保藏時(shí),用新鮮培養(yǎng)物接種,應(yīng)檢查純度和特征后,方可進(jìn)行保藏;
② 保藏過(guò)程中,需經(jīng)常觀察斜面是否干燥,如干燥, 需重新移種;
③ 使用菌種時(shí),先將菌種管傾斜使液體石蠟流至一邊,再用接種針挑取培養(yǎng)物接種到新鮮斜面上培養(yǎng),待長(zhǎng)出新培養(yǎng)物后,再移種一次到新斜面上即可使用;
④ 將沾有少量液體石蠟的接種針浸于95%酒精中片刻,再燒灼滅菌,以免直接在酒精燈下燒灼時(shí),液體石蠟四濺,引起污染;
⑤ 液體石蠟在菌種管中高出培養(yǎng)基的高度要嚴(yán)格控制,如太多,會(huì)影響菌種交換氣體,使保藏效果不好;如太少,斜面容易干燥,將縮短保藏期。一般以高出斜面1cm為宜;
⑥ 制備無(wú)菌液體石蠟時(shí),每管裝量不能太多,否則分裝到菌種培養(yǎng)基中易造成污染。
菌種的復(fù)蘇與保存
菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在專用超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
1. 菌種的復(fù)蘇
把凍干菌種管、滅菌1ml 滴管、雙碟、鑷子、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支,移入超凈工作臺(tái)或生物安全柜。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕,再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干,用75%乙醇棉擦凈,放在滅菌雙碟內(nèi),待干。點(diǎn)燃酒精燈,將菌種管的封口一端在火焰上,燒灼紅熱,用滅菌滴管吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,滴在灼熱的菌種管封口一端,使驟冷而炸裂。
取滅菌鑷子,在火焰旁,將炸裂的管口打開,放入滅菌雙碟內(nèi),另取1支滅菌滴管,在火焰旁吸取營(yíng)養(yǎng)肉湯少許,加至菌種管底部,將凍干菌攪動(dòng)促使溶解,隨即吸出管內(nèi)菌液,分別接種至營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi),并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi),將已接種的營(yíng)養(yǎng)肉湯及營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h。
取出培養(yǎng)物,仔細(xì)觀察菌苔形態(tài)、有無(wú)雜菌、涂片、革蘭氏染色鏡檢,呈典型菌落后,轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型,可進(jìn)行平板分離單菌落。
2 菌種的傳代與保存
方法(1):菌斜面(保存)
培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備,如斜面已無(wú)冷凝水者,不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期。
冰箱取出的菌種斜面,應(yīng)在室溫放置約30分鐘,待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái)。
點(diǎn)燃酒精燈,用左手握住菌種斜面,將管口靠進(jìn)火焰旁,右手拿接種棒后端,將接種環(huán)燒紅30秒,隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼,往返通過(guò)3次。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼,右手用無(wú)名指、小指及掌部夾住棉塞,撥開棉塞,將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下,稍冷卻再移至菌苔上,刮去少量菌苔,隨即取出接種棒,并將菌種管口移至火焰旁。
堵上棉塞,左手將菌種管放下,取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面1支,照上述操作打開棉塞,將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部,由底向上,將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng),使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒,在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上,然后將接種過(guò)細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時(shí),霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日。取出后放人冰箱保存,一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次。
方法2:菌斜面-營(yíng)養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態(tài)不典型可純化,按下列方法傳代(分離菌落): 用接種環(huán)取上述菌管(斜面)菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5mL/支,已滅菌),置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后,再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液(濃菌液),接種于分離平板,置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí),用接種針選典型菌落劃線于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面,置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)。一般同時(shí)接種幾支管,其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中,其它用做工作菌種。
常用分離平板:
大腸埃希菌——EMB瓊脂平板;
銅綠假單胞菌——溴化十六烷三甲銨瓊脂培養(yǎng)基;
金黃色葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。
3 菌懸液的制備
取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺(tái)或生物安全柜,放置室溫后, 用接種環(huán)取菌苔少許接種置營(yíng)養(yǎng)肉湯中(5mL/支,已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí),取出備用。
一般于冰箱中保存可用7天。
4 對(duì)照用菌液制備
取上述培養(yǎng)好的營(yíng)養(yǎng)肉湯菌懸液(濃菌液1mL,加到9mL0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻,為10-1,再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液混勻,為10-2 ……
以此類推,稀釋至含活菌數(shù)在50~100個(gè),用平板計(jì)數(shù)。
此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽(yáng)性對(duì)照,可在1天內(nèi)使用。
5.菌種保管
菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé),保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處,確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí),必須做好交接工作。
菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本,包括名稱、分離日期、鑒定日期、鑒定者、主要鑒定性能,并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因。
各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種。一般每移種3次后作一次全面鑒定。注意菌種有無(wú)污染和變異,如發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí),應(yīng)及時(shí)更換。
購(gòu)置菌種,應(yīng)有介紹信。全部保存菌種應(yīng)具備清單,并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告。