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一、PCR實(shí)驗(yàn)室裝修知識
這里著重介紹PCR實(shí)驗(yàn)室裝修的功能區(qū)劃分，建議從3方面來考慮，即：普通實(shí)驗(yàn)區(qū)、污染控制區(qū)、氣流組織。
1.普通實(shí)驗(yàn)區(qū)
包括產(chǎn)物分析區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、樣品制備區(qū)、試劑準(zhǔn)備區(qū)這4個區(qū)域。
2.污染控制區(qū)
此區(qū)域的規(guī)劃有3套方案，第1套為各功能間相互串通，以套間方式進(jìn)入人流/物流；第2套為設(shè)置獨(dú)立緩沖間，人流/物流分道，流程相鄰間設(shè)置物流傳遞窗；第3套為設(shè)置共用緩沖間/緩沖走廊。
3.氣流組織
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單相的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流和氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證個實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
PCR實(shí)驗(yàn)室裝修的氣流組織需要從原始試劑混配室、DNA提取室、PCR擴(kuò)增室、檢測室、送風(fēng)口這5方面來考慮。
①原始試劑混配室：房間壓差為正壓，配備有潔凈工作臺，以防止其他功能間對本房間的污染。
②DNA提取室：房間壓差為負(fù)壓，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止提取核酸產(chǎn)生的氣溶膠對工作人員的傷害及擴(kuò)散污染。
③PCR擴(kuò)增室：房間壓差為負(fù)壓，與DNA提取室一樣，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止擴(kuò)增產(chǎn)物造成的擴(kuò)散污染。
④檢測室：房間壓差為負(fù)壓，與DNA提取室、PCR擴(kuò)增室一樣，配備有排風(fēng)系統(tǒng)，以防止相關(guān)污染。
⑤送風(fēng)口：采用的是頂送風(fēng)，側(cè)下回/排風(fēng)方式。
二、PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)知識
這里著重介紹PCR走廊、傳遞窗這2方面的最新知識。
1、PCR走廊
PCR走廊并不是標(biāo)配，進(jìn)深不夠時不要做PCR走廊，且PCR走廊會增加交叉污染。
Tips：這4個分區(qū)(試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、核算擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū))原本就不需連接在一起，且在物理空間上必須是完全相互獨(dú)立的，各區(qū)域無論在空間上還是在使用中，應(yīng)當(dāng)始終處于完全的分隔狀態(tài)，不能有空氣的直接相通。
2、傳遞窗
并非必須設(shè)置(只要不涉及潔/污分流就不需要設(shè)置傳遞窗)，但一般實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)/實(shí)驗(yàn)人員喜歡設(shè)置。
Tips：傳遞窗的本質(zhì)—同緩沖間，是物流的緩沖間。在PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)中，試劑準(zhǔn)備和標(biāo)本制備間是重點(diǎn)保護(hù)的區(qū)域，此處最好不要加傳遞窗，防止交叉污染。實(shí)驗(yàn)中的污染風(fēng)險主要來自于核酸擴(kuò)增時的加樣行為，但由于操作在生物安全柜(起超凈臺的作用，最新做法)內(nèi)進(jìn)行，且確�？諝獠煌庖�，因此不存在污染。
三、PCR實(shí)驗(yàn)室的管理要點(diǎn)：
1、樣品制備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的制備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施；
未設(shè)緩沖間時工作區(qū)域?yàn)樨?fù)壓或減壓，可安裝排風(fēng)系統(tǒng)。所有的器具在使用前應(yīng)經(jīng)過徹底清洗并消毒，防止交叉污染。主要設(shè)備有冰箱、生物安全柜（或潔凈工作臺、排風(fēng)柜）、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、恒溫水浴、上下水裝置、廢棄物容器、紫外燈。根據(jù)制備樣品的性質(zhì)和要求決定操作臺是選用生物安全柜、潔凈工作臺還是排毒柜，如疾病控制中心、臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般選用生物安全柜，植物轉(zhuǎn)基因、檢疫等可選用排毒柜樣品制備需要較高潔凈條件的選用潔凈工作臺。
1）PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的產(chǎn)物DNA克隆不能在這個房間操作。
2）組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。
3）用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
4）DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
5）大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。
6）管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。
7）任何時候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。
2、樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR
RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會。為了避免這一問題，反轉(zhuǎn)錄一步可以在樣品準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行。在RNA-PCR中應(yīng)用UNG以防止污染的方法也有報道。
3、前PCR區(qū)
必須有專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)的區(qū)域，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
4、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
未設(shè)緩沖間的試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)，工作區(qū)域?yàn)檎龎�。用于擴(kuò)增的試劑應(yīng)冰凍儲存。主要設(shè)備有天平、冰箱、離心機(jī)、加樣器、振蕩器、紫外燈。
1）所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染。
2）所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的－新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
3）在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入貯存的試劑0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
4）所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。
5）所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
6）新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。
7）樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。
5、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
1）可以把即刻可用的“主混合物”溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用。
2）如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
3）作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
4）陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
5）當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
6）由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
6、后PCR區(qū)
PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。
