PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備②引物的質(zhì)量與特異性③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。

一、模板

1、模板中含有雜蛋白質(zhì)

2、模板中含有Taq酶抑制劑

3、模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈，特別是染色體中的組蛋白

4、在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚

5、模板核酸變性不徹底。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

二、酶失活

需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性。需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。

三、引物

引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想、容易彌散的常見原因。有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：

①選定一個好的引物合成單位。

②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計不合理，如引物長度不 夠，引物之間形成二聚體等。

四、Mg2+濃度

Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

五、反應(yīng)體積的改變

通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

六、物理原因

變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標準的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。

七、靶序列變異

如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。

出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。

一、引物設(shè)計不合適

選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。需重新設(shè)計引物。

二、靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染

這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。

這種假陽性可用以下方法解決：

①操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。

②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒。所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。

③必要時，在加標本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性�？苫ハ嗥唇�，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。

PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān)。

其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。

其對策有：

①必要時重新設(shè)計引物。

②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。

③降低引物量，適當增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

④適當提高退火溫度或采用二溫度點法(93℃變性，65℃左右退火與延伸)。

出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶

PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。

其對策有：

①減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。

②減少dNTP的濃度。

③適當降低Mg2+濃度。

④增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。

當PCR結(jié)果不甚滿意時，首先檢查以下幾方面并遵照執(zhí)行：

1、將PCR反應(yīng)的試管與反應(yīng)板緊貼。

2、當酶反應(yīng)混合物以70℃“熱啟動”開始循環(huán)時，切記在加入酶后稍微振蕩一下，因為在0.2-ml的PCR管中不能均勻傳熱。

3、不要隨意減少dNTP的用量，它是一個系統(tǒng)的因素，必須與其它成份保持平衡。

4、對于有問題的PCR反應(yīng)，例如模板的量少，模板不純和環(huán)狀模板等，先嘗試加Taq酶前的體系進行預(yù)變性，后加模板進行正常PCR擴增。

沒有擴增產(chǎn)物：

1、在提供MgCl 2 緩沖液中，以0.25mmol/L為梯度增加MgCl 2 濃度；無MgCl2的緩沖液以0.5 mmol/L為梯度增加MgCl2濃度。

2、泳道中出現(xiàn)模糊條帶，如果DNA模板中存在RNA，則按上述提示濃度補加MgCl 2 ，因為在PCR反應(yīng)中可能缺少游離的Mg 2+ 。

3、檢查退火溫度和變性條件，如果有需要的話，可降低退火溫度。

4、檢查模板和引物的用量。

5、增加循環(huán)次數(shù)和/或模板DNA的用量。

泳道中出現(xiàn)模糊條帶：

1、減少循環(huán)次數(shù)或模板DNA的用量。

2、提高退火溫度，但不要超過68℃。

3、重新設(shè)計引物或設(shè)計更長的引物。

其他值得注意的條件：

1、建議使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃時不能有效地使模板變性。

2、最佳反應(yīng)體積為50ml，推薦用30ml礦物油覆蓋（對蓋子加熱的PCR儀可以不加）。

3、大多數(shù)反應(yīng)中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多數(shù)情況下可以得到滿意的結(jié)果。

4、優(yōu)化Mg2+的濃度是必需的。

5、基因組DNA模板的質(zhì)量顯著影響PCR反應(yīng)。因此推薦使用瓊脂糖凝膠電泳來檢測DNA的長度。DNA片段長度可以超過50kb，傳統(tǒng)的基因組DNA能擴增片段至10kb。

6、要擴增更長的片段應(yīng)使用超純或高分子量的DNA。請查閱高分子量DNA提取操作過程相關(guān)文獻。

7、降低二級結(jié)構(gòu)和引物二聚物形成的可能性。進行長片段PCR擴增時，引物長度一般為24~34個核苷酸，溶點在60~68℃間。使用這類引物可提高PCR反應(yīng)的退火溫度來增加反應(yīng)的特異性。這點非常重要，長片段擴增的效果往往受到非特異性短片段優(yōu)先擴增的影響。

8、變性：第一步變性在94℃下進行2分鐘。在循環(huán)過程中盡可能縮短變性時間（94℃下進行20--30秒），除非模板中富含GC，則95℃下變性30秒。這可以防止DNA脫嘌啉和鏈斷裂，對于所需擴增的基因組DNA片段終長度超過12 kb時，應(yīng)該盡可能的降低變性溫度。

9、延伸：68--72℃下進行延伸操作。

10、循環(huán)延伸：盡量采用循環(huán)延伸的條件，若PCR儀無此功能，則必須增加延伸的時間，例如在擴增10kb片斷時，延伸時間用10分鐘替代原來的8分鐘。

11、長片斷PCR系統(tǒng)擴增的片斷其3’-末端帶有一個突出的A，因此建議采用T/A克隆。若要進行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶將PCR產(chǎn)物補平后再進行。

12、測序時因酶的混合物帶有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法進行測序不能產(chǎn)生均一的（染色體）帶型。

引物設(shè)計：

1、一般長度20-30bp；

2、至少50%的GC含量；

3、避免引物二聚體和二級結(jié)構(gòu)；

4、引物對的Tm值應(yīng)該接近。