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技術(shù)丨實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌環(huán)境怎樣監(jiān)控和檢測(cè)?

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2019-10-28
核心提示:微生物檢測(cè)人員天天都需要在無(wú)菌室工作,在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作,為了保證我們檢測(cè)的準(zhǔn)確性,我們必須要求無(wú)菌室以及工作
 微生物檢測(cè)人員天天都需要在無(wú)菌室工作,在超凈臺(tái)或者生物安全柜里操作,為了保證我們檢測(cè)的準(zhǔn)確性,我們必須要求無(wú)菌室以及工作臺(tái)符合要求,那我們應(yīng)該怎樣進(jìn)行驗(yàn)證呢?

 

下面我們介紹一下環(huán)境中無(wú)菌或殺菌效果應(yīng)如何檢查。

 

01
紫外燈殺菌效果檢查 

 

紫外燈在使用過(guò)程中輻射強(qiáng)度會(huì)逐漸降低,影響其殺菌效果,故應(yīng)該定期檢查。紫外燈的殺菌有效波長(zhǎng)是253.7nm,其強(qiáng)度可以用中心波長(zhǎng)254nm的紫外線強(qiáng)度計(jì)測(cè)定。在沒有紫外線強(qiáng)度計(jì)的情況下可以采用生物學(xué)替代。


生物學(xué)測(cè)試簡(jiǎn)要步驟如下:選用枯草芽孢桿菌ATCC 9372,制成106CFU/mL~108CFU/mL濃度的菌懸液;選用經(jīng)脫脂處理的0.5cm×1.0cm大小的布片或鋁片,高壓滅菌后用作載體;每個(gè)載體上滴一滴制備好的菌懸液,干燥后備用;將8個(gè)染菌載體放于無(wú)菌器皿中,置于紫外燈下1m~1.5m處,開啟紫外燈照射,于0.5h、1h、1.5h和2h各取出2個(gè)染菌載體,分別投入盛有5mL緩沖蛋白胨水的洗脫液;系列稀釋后進(jìn)行平板計(jì)數(shù);同法取8個(gè)染菌載體用做陽(yáng)性對(duì)照,操作除不經(jīng)紫外此昂照射外與試驗(yàn)組相同。

 

殺滅率=(陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)-試驗(yàn)組回收菌數(shù))/陽(yáng)性對(duì)照回收菌數(shù)×100%

殺滅率大于99.9%時(shí),認(rèn)為紫外燈殺菌效果合格。


 

二、
無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查

 

無(wú)菌室空氣質(zhì)量檢查應(yīng)按照采樣計(jì)劃,根據(jù)情況對(duì)處于空態(tài)、靜態(tài)和正常運(yùn)行的風(fēng)險(xiǎn)區(qū),使用適當(dāng)?shù)膬x器采集空氣中微生物,測(cè)定并監(jiān)控風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣的微生物污染?諝鈶腋∥⑸锏牟蓸雍陀(jì)數(shù)方法多種多樣,根據(jù)不同采樣目的決定具體的采樣方法和采樣器。因采樣器的采集效率不同,應(yīng)慎重選擇合適的方法和設(shè)備。采樣器分為兩類:被動(dòng)式采樣器,如落菌盤;主動(dòng)式采樣器,如過(guò)濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。

 

01

沉降法


落菌盤等被動(dòng)式空氣微生物采樣器不能測(cè)量空氣中的微生物的總數(shù),而是測(cè)量空氣中微生物在表面的沉降率。只要確定單位時(shí)間落菌盤上微生物的數(shù)量,再根據(jù)落菌盤的暴露面積與暴露時(shí)間之間的關(guān)系,即可大致計(jì)算出空氣中微生物的數(shù)量。


面積小于30m2的室內(nèi)設(shè)一條對(duì)角線取3點(diǎn),在其中心以及兩端距墻1m處各取1點(diǎn);面積大于30m2的室內(nèi)房間四面距墻1m和中央各放置一個(gè)平皿,高度為實(shí)驗(yàn)臺(tái)高度。培養(yǎng)基平皿開蓋暴露10min,然后蓋上蓋子倒放,培養(yǎng)48h,計(jì)數(shù)每個(gè)平皿上的菌落數(shù)。


日常監(jiān)控時(shí),可以設(shè)定可接受的菌落數(shù)限值。一般無(wú)菌室所有的取樣平皿上的細(xì)菌總數(shù)應(yīng)小于15個(gè)。空氣質(zhì)量良好的無(wú)菌室,通常每個(gè)平皿上生長(zhǎng)的細(xì)菌不超過(guò)2個(gè)菌落數(shù)。

 

02

空氣過(guò)濾法


空氣采樣除了自然沉降法外,還可以使用專門的主動(dòng)式采樣器。主動(dòng)式采樣器可以評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)區(qū)空氣微生物的特征。主動(dòng)式采樣器主要包括過(guò)濾采樣器、撞擊采樣器、沖擊采樣器等。


撞擊采樣器可以分為狹縫式采樣器、離心式采樣器和針孔式采樣器。狹縫式采樣器由附加的真空抽氣泵抽氣,通過(guò)采樣器的縫隙式平板,將采集的空氣噴射并撞擊到緩慢旋轉(zhuǎn)的平板培養(yǎng)基表面上,附著的活微生物粒子經(jīng)過(guò)培養(yǎng)后形成菌落,予以計(jì)數(shù)。離心式采樣器由于內(nèi)部風(fēng)機(jī)的高速旋轉(zhuǎn),氣流從采樣器前部吸入從后部流出,在離心機(jī)的作用下,空氣中的活微生物粒子有足夠的時(shí)間撞擊到專用的固形培養(yǎng)條上,經(jīng)培養(yǎng)后形成菌落,予以計(jì)數(shù)。


過(guò)濾式空氣采樣器是最常用、最簡(jiǎn)單的空氣采樣器。過(guò)濾式采樣器有采樣頭、濾器、流量計(jì)和抽氣泵組成。過(guò)濾式采樣器的結(jié)構(gòu)如圖:



開動(dòng)電機(jī)后,抽氣泵工作,帶動(dòng)空氣吸入采樣頭,空氣通過(guò)濾器的時(shí)候,大于濾膜孔徑的顆粒被阻留,當(dāng)達(dá)到預(yù)先設(shè)定吸氣體積后抽氣泵停止工作,將濾膜取出轉(zhuǎn)貼到培養(yǎng)基上,培養(yǎng)后計(jì)算空氣中微生物的濃度。過(guò)濾式采樣器捕獲效率高,但是濾膜材料可能影響微生物的存活率,還有采樣阻力大、流量易變的缺陷。


在沒有空氣采樣器的情況下,可以自己組裝如下圖的空氣錯(cuò)率采樣裝置,注意組裝連接處必須密不透風(fēng)。



打開圖中大瓶的龍頭,空氣就被抽入無(wú)菌水中。待4L水流完,就有4L空氣通過(guò)小瓶中的無(wú)菌水,也就是4L空氣中的微生物被留存在50mL無(wú)菌水中。無(wú)菌吸取1mL過(guò)濾的水樣進(jìn)行平板計(jì)數(shù),做2個(gè)平行。37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。

每升空氣中的細(xì)菌數(shù)為:2個(gè)平皿上細(xì)菌數(shù)量的平均值×50/4。


 

三、
無(wú)菌室物體表面微生物污染檢查

 

表面微生物污染的檢查需要使用接觸器或拭子,獲得某表面某時(shí)間點(diǎn)的微生物數(shù)量。


接觸器以容器內(nèi)已知面積的固態(tài)培養(yǎng)介質(zhì)與表面接觸,接觸面積應(yīng)大于20cm2,均勻用力將整個(gè)營(yíng)養(yǎng)介質(zhì)壓住表面幾秒鐘,不得移動(dòng)。然后將裝置放回容器內(nèi),再清潔采樣表面,清除殘留營(yíng)養(yǎng)物。接觸器培養(yǎng)后顯現(xiàn)的菌落可以給出原表面微生物的存活狀況的鏡像“圖”。


使用拭子更為簡(jiǎn)單和靈活,用拭子擦拭某個(gè)表面,它抹去的微生物數(shù)量就可以計(jì)算出了。對(duì)接觸裝置觸及不到的、不平或有凹陷的非吸收性大表面,用拭子采樣特別方便。棉拭子的操作方法如下:

準(zhǔn)備材料:自制無(wú)菌棉拭子或購(gòu)買商品化的無(wú)菌棉拭子、內(nèi)徑10cm×10cm無(wú)菌規(guī)格板、無(wú)菌生理鹽水、培養(yǎng)基平皿。


如果取樣物體是平面的,將無(wú)菌規(guī)格板放在物體表面,用浸濕的無(wú)菌棉拭子在無(wú)菌規(guī)格板空心處橫豎涂抹均勻,涂抹時(shí)隨之轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子,剪去棉拭子與手接觸部分,將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌生理鹽水中待檢。

將采樣管敲打80次以上是棉拭子上的細(xì)菌充分?jǐn)U散,做適當(dāng)稀釋,進(jìn)行平板計(jì)數(shù),37℃培養(yǎng)48h計(jì)數(shù)。

細(xì)菌總數(shù)(CFU/cm2=(平皿上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù))/采樣面積(cm2

 

四、
人員接觸面無(wú)菌檢查

 

人員與檢測(cè)對(duì)象的接觸面主要是手。

被檢人員洗手消毒后,五指并攏。將浸泡過(guò)的棉拭子沿雙手指屈從指根到指端往返涂擦兩次,涂擦的同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)棉拭子。剪去操作者手接觸部位,將棉拭子放入裝有一定體積的無(wú)菌室生理鹽水中待檢。

“無(wú)菌室物體表面細(xì)菌污染檢查”的方法進(jìn)行樣品處理、接種、培養(yǎng)、計(jì)數(shù)和報(bào)告結(jié)果。

編輯:songjiajie2010

 
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