磷酸鹽緩沖稀釋液
貯存液：
磷酸二氫鉀(KH₂PO₄) 34.0g
蒸餾水 500mL
用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2（圖1-1、1-2），用蒸餾水稀釋至1000 mL后貯存于冰箱。
稀釋液：用蒸餾水稀釋1.25mL貯存液至1000mL,分裝于合適容器,121℃高壓滅菌15min。

2. 培養(yǎng)基制作

① 計(jì)算出所需數(shù)量，用電子稱、稱量紙、藥勺來稱取。

② 放入比所用蒸餾水大的燒瓶中，使之充分混勻于蒸餾水后加熱溶解并煮沸。

※ 備注：即使是同一培養(yǎng)基，各個廠家的配制方法多少有些不同，所以一定要充分參照培養(yǎng)基上的說明。

2.1 傾注培養(yǎng)培養(yǎng)基：

● 平板計(jì)數(shù)瓊脂等：高壓滅菌后保存，使用時加溫溶解。
● 去氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基：使用時將培養(yǎng)基粉末加溫溶解。

※ 備注：傾注培養(yǎng)時，向培養(yǎng)基分注的步驟參照下述的注意事項(xiàng)

①樣液稀釋以及從接種到培養(yǎng)基混合完畢，最好在15分鐘以內(nèi)完成。

②每個平皿的分注量約15-20ml。分注后將平皿傾斜和旋轉(zhuǎn)使之充分混合，但要注意不要讓培養(yǎng)基從平皿內(nèi)溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。

③分注時三角燒瓶掛有培養(yǎng)基滴時，下一次分注的培養(yǎng)基可能被燒瓶外壁的細(xì)菌污染，所以要用酒精棉擦拭，再將瓶口用火焰滅菌。

2.2 平板培養(yǎng)基：
平板培養(yǎng)基是將溶解后的培養(yǎng)基分注15-20ml到無菌平皿里，使之凝固。

●TCBS瓊脂培養(yǎng)基、DHL瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后，分注、凝固、干燥表面。為了防止沉淀的發(fā)生，加溫溶解后要充分混勻（注意不要起泡）。

●EMB瓊脂培養(yǎng)基：高壓滅菌后，分注、凝固、干燥表面。

●卵黃甘露醇高鹽瓊脂培養(yǎng)基：將雞蛋放在95%酒精中浸泡1小時左右，用酒精棉（紗布）擦拭蛋殼表面，打開雞蛋取出卵黃。加入經(jīng)高壓滅菌后冷卻到55-60℃培養(yǎng)基里（6%卵黃）攪拌搖勻凝固后干燥表面（攪拌時不要起泡）。若培養(yǎng)基溫度過高，卵黃凝固，過低則培養(yǎng)基分注時開始結(jié)塊，所以操作要迅速。

※ 備注：分注后將平皿蓋打開置于無菌工作臺/恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)使培養(yǎng)基表面干燥。
干燥時間基準(zhǔn)如下：
無菌超凈臺：15分鐘     
37℃恒溫箱內(nèi)倒置：20-30分鐘

2.3 斜面/高層斜面培養(yǎng)基：

    

加溫溶解后的培養(yǎng)基分注到小試管3-4ml，中試管8-10ml。高壓滅菌后將試管冷卻至50℃左右（以防斜面上冷凝水太多），將試管口端擱在合適高度的器具上，擱置斜面長度以不超過試管總長一半為宜。高層斜面培養(yǎng)基制成斜面高1/3，高層為2/3。

●營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到中試管，高壓滅菌后制成斜面。

●TSI瓊脂培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到小試管，高壓滅菌后制成高層斜面。

2.4 液體培養(yǎng)基

加溫溶解后的培養(yǎng)基和高層/斜面培養(yǎng)基一樣，分注。一般液體培養(yǎng)基因過度加熱易引起培養(yǎng)基變質(zhì),所以加熱（加溫溶解、高壓滅菌）后用流動水等急速冷卻。

●EC、BGLB培養(yǎng)基：加溫溶解后分注到放有倒立的發(fā)酵管的試管后高壓滅菌，滅菌后用流動水急速冷卻。

●EEM培養(yǎng)基：加溫溶解后于三角瓶在100℃滅菌30分鐘。

※ 備注：每批培養(yǎng)基制備后，應(yīng)仔細(xì)檢查一遍，如發(fā)現(xiàn)破裂、水分浸入、色澤異常、瓶塞被培養(yǎng)基污染等，均應(yīng)挑出棄去。培養(yǎng)基應(yīng)存放于冷暗處，最好放于冰箱內(nèi)。放置時間不宜超過一周，傾注的平皿培養(yǎng)基不宜超過3天。每批培養(yǎng)基均必須附有明顯的標(biāo)識。

3. 基本操作：

3.1 滅菌方法：
①酒精殺菌：用75%的酒精及酒精棉，用于手指、實(shí)驗(yàn)臺、工器具、樣品外包裝等的殺菌。
②火焰滅菌：檢查中常用酒精燈/煤氣燈，將燒瓶、試管、吸管、剪刀、鑷子瓶口部或前端，還有接種針、接種環(huán)接種前后通過火焰。
③ 高壓滅菌：主要是吸管、培養(yǎng)基、稀釋水以及檢查完畢后的培養(yǎng)基等無菌。
④煮沸滅菌：在沸水中加熱15-30min的方法。用于鑷子、剪刀、吸球等的工具滅菌。

3.2  分離轉(zhuǎn)種培養(yǎng)

3.2.1 平皿劃線：

3.2.1.1分段劃線：用于含菌量較多的樣品。

右手持接種環(huán)柄，將接種環(huán)垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環(huán)和絲）必須燒紅，以達(dá)到滅菌目的，然后將除手柄部分的金屬桿全用火焰灼燒一遍，尤其是接鎳鉻絲的螺口部分，要徹底灼燒以免滅菌不徹底。（圖3-1、3-2）

用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，將滅過菌并冷卻的接種環(huán)挑取菌（可在瓊脂表面邊緣空白處試溫度，若發(fā)出濺潑聲，表示太燙）先在平板培養(yǎng)基的一邊輕輕研磨作第一次平行劃線，再轉(zhuǎn)動平皿約70度角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次平行劃線，再用同樣的方法通過第二次劃線部分作第三次劃線或通過第三次平行劃線部分作第四次平行劃線。（圖3-3、3-4）

3.2.1.2連續(xù)劃線：含菌量不多的樣品。

先將接種環(huán)用火焰滅菌，待冷卻后挑取菌，涂于平板的上端，隨即向下連續(xù)平行劃線。（圖3-5）

※備注：

（1）劃線時接種環(huán)與平板表面所成的角度為45度角，以免劃破瓊脂。劃線要盡量直、密、勻而不重復(fù)。（圖3-7）
（2）將沾有菌苔的接種環(huán)在火焰上燒紅滅菌。先在火焰內(nèi)焰中燒灼，使其干燥后，再在外焰中燒紅，以免菌苔驟熱，使菌體爆濺，造成污染。（圖3-6）            

 3.2.2 涂布方法：
將菌懸液小心滴在平板培養(yǎng)基表面中央位置（圖3-8），右手拿無菌涂布棒平放在平板培養(yǎng)基表面，將菌懸液先沿一條直線輕輕來回推動，使之分布均勻，然后改變方向沿另一條垂直線來回推動，平板內(nèi)邊緣處可改變方向用涂布棒再涂布幾次，使菌液均勻吸收  （圖3-9、3-11）。（或?qū)�無菌涂布棒平放在平板培養(yǎng)基表面，將菌懸液沿同心圓方向輕輕地向外擴(kuò)展）使之分布均勻（圖3-10）。室溫下靜置5～l0min，使菌液滲透于培養(yǎng)基。

3.2.3 液體接種法
3.2.3.1 由斜面培養(yǎng)物接種至液體培養(yǎng)基：用接種環(huán)從斜面上沾取少許菌苔，接至液體培養(yǎng)基時應(yīng)在管內(nèi)靠近液面試管壁上將菌苔輕輕研磨并輕輕振蕩，或?qū)⒔臃N環(huán)在液體內(nèi)振搖幾次即可。

3.2.3.2由液體培養(yǎng)物接種液體培養(yǎng)基時：可用接種環(huán)或接種針沾取少許液體移至新液體培養(yǎng)基即可。也可根據(jù)需要用吸管、滴管或注射器吸取培養(yǎng)液移至新液體培養(yǎng)基即可。      （圖3-12、3-13） 
※ 備注：接種液體培養(yǎng)物時應(yīng)特別注意勿使菌液濺在工作臺上或其他器皿上，以免造成污染。如有濺污，可用酒精棉球、消毒液等擦凈。凡吸過菌液的吸管或滴管，應(yīng)立即放入盛有消毒液的容器內(nèi)或高壓滅菌。

3.2.4 斜面接種法
將菌種斜面培養(yǎng)基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜面培養(yǎng)基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在后，斜面向上管口對齊，應(yīng)斜持試管呈45～50度角，并能清楚地看到兩個試管的斜面，用右手的小指和手掌之間及無名指和小指之間撥出試管塞，將試管口在火焰上通過，以殺滅可能沾污的微生物。試管塞應(yīng)始終夾在手中如掉落應(yīng)更換無菌試管。
將灼燒滅菌的接種環(huán)插入菌種管內(nèi)，先接觸無菌苔生長的培養(yǎng)基上，待冷卻后再從斜面上刮取少許菌苔取出，接種環(huán)不能通過火焰，應(yīng)在火焰旁迅速插入接種管。在試管中由下往上劃線。接種完畢，接種環(huán)應(yīng)通過火焰抽出管口，并迅速塞上試管塞。再重新仔細(xì)灼燒接種環(huán)后，放回原處，并塞緊試管塞。將接種管做好標(biāo)記后再放入試管架，即可進(jìn)行培養(yǎng)。（圖3-14）

3.2.5 穿刺接種法

接種高層或半高層斜面培養(yǎng)管時，用接種針挑取菌落，向培養(yǎng)基中心穿刺，一直插到接近管底0.4cm處，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養(yǎng)基內(nèi)左右移動，以使穿刺線整齊，便于觀察生長結(jié)果。（圖3-15、3-16）