一、  神經干細胞的分離

無菌條件下取新生SD大鼠（出生48h內）腦組織，D-Hanks液充分漂洗后，在解剖顯微鏡下剝離腦膜，準確分離海馬，用眼科剪將海馬剪碎后，再轉移到DMEM/F12（1:1）加B27 和bFGF（20ng/ml）的無血清培養(yǎng)基，吸管吹打機械分離制作單細胞懸液，臺盼藍染色后細胞計數(shù)，調整細胞濃度為5×104~5個/ml，置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細胞懸液500μl。待神經球形成后再次機械分離克隆制作單細胞懸液，仍以5×104個/ml的細胞濃度置于24孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，每孔加入細胞懸液500μl。此后每7d機械分離克隆傳代1次，方法同前。

 

二、BrdU標記

將BrdU溶于無血清培養(yǎng)基，過濾除菌后加入神經球形成后再次機械分離克隆制作的單細胞懸液中（BrdU終濃度為5μmol/L），培養(yǎng)7d待新的神經球形成后，將神經球轉移到預先涂布有多聚賴氨酸的培養(yǎng)板中，貼壁2h行BrdU免疫細胞化學染色。

 

三、  神經干細胞的誘導分化

選取部分上述傳代后形成的次代神經球種植于預先涂布有多聚賴氨酸的24孔培養(yǎng)板中，并加入有血清培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的DMEM/F12），一部分神經球于貼壁2h后行Nestin免疫細胞化學染色，另一部分神經球繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其生長分化情況。另將一部分次代神經球機械分離制成單細胞懸液后加入有血清培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)，7d后分別行Tuj1 、GFAP 、Galc 免疫細胞化學染色。

 

四、  條件培養(yǎng)液的制備

取1g雞胚的后肢骨骼肌組織，加入9mlD-Hanks液中冰浴勻漿15min，離心獲得上清液，過濾除菌后，加兩倍體積DMEM/F12培養(yǎng)基制成條件培養(yǎng)液備用。

 

五、  神經干細胞的定向誘導分化

將一部分次代神經球機械分離制成單細胞懸液后分別加入條件培養(yǎng)液和有血清培養(yǎng)基（含10％胎牛血清的DMEM/F12）中對照貼壁培養(yǎng)，7d后均行ChAT免疫細胞化學染色。

 

六、  免疫細胞化學染色

培養(yǎng)細胞用4％多聚甲醛固定30min后，PBS充分漂洗，然后按ABC法分別行鼠抗Nestin，鼠抗Tuj1，兔抗GFAP，鼠抗Galc，鼠抗Brdu免疫細胞化學染色，用DAB和H2O2作為呈色劑，陽性著色為棕黃色。具體方法為：

（1） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（2） 0.3%H2O2/0.05M PBS室溫 30min

（3） 0.3%Triton-100/0.05M PBS 37 ℃，15min

（4） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（5） 5%羊血清/0.05M PBS 37 ℃，15min

（6） I抗（2%羊血清/0.05M PBS配） 4℃，48h

（7） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（8） II抗（2%羊血清/0.05M PBS配，1：200） 37 ℃，1.5h

（9） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（10） AB復合物（0.05M PBS配，1：100） 37 ℃，1.5h

（11） 0.05M PBS漂洗 10min×3次

（12） Tris-HCl緩沖液 37 ℃，15min

（13） DAB顯色 20min

（14） 蒸餾水漂洗 10min×3次

 

然后，為進一步證明實驗組的細胞是膽堿能神經元，將已作完ChAT免疫細胞化學染色的細胞用PBS終止顯色以及進一步封閉非特異性結合位點后， 仍用ABC法行Tuj1免疫細胞化學染色，用含有NiCl的DAB和H2O2作為呈色劑,雙標陽性細胞著色為藍黑色。