基本原理
發(fā)酵工業(yè)是既古老又嶄新的工業(yè),它的形成經(jīng)歷了漫長(zhǎng)的歲月。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,發(fā)酵工業(yè)不斷地得到發(fā)展和充實(shí),F(xiàn)代發(fā)酵工業(yè)就是傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)與現(xiàn)代DNA重組、細(xì)胞融合等新技術(shù)相結(jié)合,而發(fā)展起來(lái)的現(xiàn)代生物技術(shù),并通過(guò)現(xiàn)代化學(xué)工程技術(shù)生產(chǎn)有用物質(zhì)或直接用于工業(yè)化生產(chǎn)的一種大工業(yè)體系,是生物技術(shù)的重要組成部分。
發(fā)酵工業(yè)在基因工程藥物的研制方面起著不可替代的作用。重組DNA技術(shù)和大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)的有機(jī)結(jié)合,使得原來(lái)無(wú)法大量獲得的天然蛋白特別是基因工程藥物能夠大量生產(chǎn),應(yīng)用于臨床的基因工程藥物的市場(chǎng)正以每年5~15%的速度增長(zhǎng)。采用高密度發(fā)酵技術(shù),可以提高菌體的密度,最終提高產(chǎn)物的比生產(chǎn)率(單位體積單位時(shí)間內(nèi)產(chǎn)物的產(chǎn)量)不僅可以減少培養(yǎng)體積、強(qiáng)化下游分離提取,還可以縮短生產(chǎn)周期,減少設(shè)備投資從而降低生產(chǎn)成本,提高市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力。
發(fā)酵工程菌除有高濃度、高產(chǎn)量、高產(chǎn)率外還應(yīng)該滿足:能利用易得的廉價(jià)原料;不致病,不產(chǎn)生內(nèi)毒素;容易進(jìn)行代謝調(diào)控;易于進(jìn)行DNA重組技術(shù)。目前應(yīng)用最多的是大腸桿菌(遺傳背景清楚、操作簡(jiǎn)便、培養(yǎng)條件容易控制、成本低)。
工程菌生長(zhǎng)繁殖需要的條件是:良好的物理環(huán)境--發(fā)酵溫度、pH值、溶氧量等;合適的化學(xué)環(huán)境--適宜工程菌生長(zhǎng)代謝所需的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的濃度,并限制阻礙生長(zhǎng)代謝的有害物質(zhì)的濃度。在發(fā)酵過(guò)程中許多控制參數(shù)對(duì)工程菌的生長(zhǎng)構(gòu)成影響,需不斷加以調(diào)整(見(jiàn)下表),從而達(dá)到優(yōu)化控制目的。
發(fā)酵工藝分為批式發(fā)酵、流加式培養(yǎng)(Fed-batch)和程控發(fā)酵
試劑的配制
1. 種子液(1000ml, pH7.0):
Trypton 16g
Yeast Extract 10g
Glycerol 20ml
NaCl 5g
2. 發(fā)酵液(600ml):
Trypton 50g
Yeast Extract 50g
Glycerol 100ml
MgSO4·7H2O 3g
3. 補(bǔ)料(2400ml):
Trypton 200g
Yeast Extract 100g
Glycerol 1000ml
MgSO4·7H2O 12g
4. 鹽(1000ml,pH7.2):
KH2PO4 20g
K2HPO4 40g
Na2HPO4·12H4O 70g
(NH4)2SO4 12g
NH4Cl 0.2g
儀器
Biostat 5L自動(dòng)發(fā)酵罐,德國(guó)B.Braun公司。
操作步驟
1.消毒所有試劑、管路等。
2.發(fā)酵罐消毒。
3.發(fā)酵用菌種篩選 取-70℃保存的甘油菌種劃平板,37℃培養(yǎng)過(guò)夜,挑取單菌落于5ml試管中,振蕩培養(yǎng)至A6000.6左右,按20ml/L接種于含種子液的500ml搖瓶中,振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)中期,作為發(fā)酵罐的種子液。
以上環(huán)節(jié)應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行前準(zhǔn)備好。
4.打開(kāi)儀器,調(diào)節(jié)相應(yīng)的參數(shù)。
5.在發(fā)酵罐中加入發(fā)酵液、鹽。
6.將種子液按40ml/L接種至發(fā)酵罐,控制適當(dāng)范圍的參數(shù):溶氧為≥30%;溫度為37℃;pH值設(shè)定為7.0,流加300ml/L的氨水以保持恒定。
7.當(dāng)發(fā)酵密度到一定范圍的時(shí)候(溶氧開(kāi)始上升)。
8.誘導(dǎo)目的蛋白表達(dá)。
9.收集菌體
10.清洗發(fā)酵罐,關(guān)閉儀器。